低水平电离辐射和铜暴露对静态生物膜细菌中抗生素抗性发生率的影响外文翻译资料

 2022-03-16 10:03

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低水平电离辐射和铜暴露对静态生物膜细菌中抗生素抗性发生率的影响

摘要：我们对于抗生素抗性细菌的环境储备知之甚少。了解环境如何在没有抗生素的情况下选择抗性特征对于制定方法来缓解这种日益严重威胁至关重要。通过环境污染间接或共同选择抗性已经被证明能增加抗生素抗性。然而，还没有将关注放到低水平电离辐射或辐射与重金属之间的相互作用对维持或选择抗生素抗性（AR）性状的影响。在这里，我们探讨辐射和铜对抗生素抗性的影响。从两个池塘的生物膜收中集细菌，一个受低放射性铯的影响，另一个是废弃农场池塘。通过实验室控制的实验，我们检查了铜浓度增加对抗生素耐药性的影响。在每个池塘的对照的抗性谱中检测到差异。低浓度（0.01mM）硫酸铜增加了抗性，但是0.5mM浓度的硫酸铜抑制了两个池塘中的AR反应。对于每个分离菌的多种抗生素抗性水平观察到类似的模式。分离物暴露于多种抗生素的第一个主要组分响应在六种分离物处理组合之间显示显着差异。这些差异通过判别函数分析清晰可见，基于6个处理组显示出不同的抗生素抗性反应模式。

介绍

全球范围内抗生素无效性持续上升令人担忧并引发关切（Palumbi，2001; Alanis，2005）。事实上，尽管医生和科学家几十年来一再发出警告，但它最终还是成为了国际关注的焦点（斯皮尔伯格等，2008年;联合国大会第70/183号决议）。对接触抗生素的直接选择，耐药菌株的选择迅速产生，并且大多数第一代药物在引入后不久就变得无效（Projan，2003，Projan和Shlaes，2004; Shlaes等，2013）。尽管公共卫生官员努力减少临床状况况下的抗生素处方（Spellberg等，2008），并减少了农业使用（Kemper，2008），但抗性还是持续增加，许多菌株已有了多重抗生素抗性（MAR）（Stepanauskas等，2006）。为了解决这个问题，一些研究人员已经确定在各种栖息地间接选择和/或共同选择是在没有任何暴露于抗生素的情况下赋予菌株抗性的机制（Alonso等，2001; Baker等，2006; Allen等， 2010）。

间接选择和共同选择已经在对暴露于重金属（Stepanauskas等，2005,2006; Baker等，2006）和其他污染物（Kadavy等，2000; Allen等，2009）的响应中观察到。 对照实验室的实验表明，分别接触各种重金属或抗生素，被选择的具有金属和抗生素抗性（Stepanauskas 等，2006）。 通过现场观察确定，即使在没有投入过抗生素的河流中，与河流沉积物和有环境污染物的河流系统相关的细菌也具有更高的抗生素抗性水平（Allen 等，2010; McArthur and Tuckfield，2000; Tuckfield和McArthur，2008; McArthur等，2016）。

电离辐射会导致DNA断裂。在极端环境之一（高水平核废料槽）中，由于非常快速的DNA修复机制（Cox和Battista，2005），细菌（耐辐射球菌）在极端辐射下继续存活。虽然高辐射水平的野外场地数量非常有限，但也有许多地方可以找到低水平的慢性辐射。这些场地包括位于美国南卡罗来纳州的萨凡纳河流域（SRS），其中各种活动已导致放射性核素进入环境（Carlton等，1994）。 SRS水生系统的主要放射性污染物为137Cs。这种铯同位素的放射性半衰期为37年，其生态半衰期取决于存在的生物体。例如，它在切尔诺贝利鱼类中的生态半衰期为0.3-4.6年（Jonsson等，1999年），而Prohl等（2006）报道了与森林和沼泽有关的各种生物的4到128年的数值。在SRS的水禽中，137Cs的生态半衰期约为4.3年（Brisbin and Kennamer，2000）。在萨凡纳河流域的运行历史上，大约2.2 * 104 GBq的放射性铯以不同的量释放到各种SRS水生栖息地中（Carlton等，1994）。

尽管20世纪的核爆炸测试造成的辐射污染非常广泛（Mabit和Bernard，2007），但现代核设施的大部分污染已经被本地化。这种普遍模式的例外包括福岛和切尔诺贝利核事故影响大面积的土地和水（Aarkrog，2003; du Bois等，2012; Mabit和Bernard，2007）。因此，长期暴露于电离辐射的地区可能会影响微生物基因组。

相比之下，地球上大部分地区一直受到沉降物的汞（Airey，1982）以及全球各行业的其他金属的污染（Han等，2002）。尽管我们知道重金属可以选择增加抗生素抗性，但我们并没有关于低水平电离辐射如何影响抗性特性的数据，也没有关于金属和辐射的组合如何与天然细菌相互作用的数据。在这里，我们介绍一个实验的结果，该实验检查了电离辐射和铜暴露对生物膜细菌中抗生素抗性发生率的影响。我们之所以选择铜，是因为SRS上的各种过程将铜释放到环境中，并且因为铜已被证明可以共同选择抗生素抗性（Berg等，2004; Baker-Austin 等，2006）。我们假设暴露于放射线和铜的细菌与单独暴露于辐射或铜的细菌相比，具有更高水平的抗生素抗性性和更高的MAR发生率。因此，我们设计了一个现场和实验室实验来测试这个假设。

方法

研究地点

样品在2016年夏季从三个位于池塘B和一个位于燃池的海岸区位置采集，从消防水池采集的作为对照。R生产反应堆的反应器流出物从1961年到1964年经过一系列运河流入池B（约85公顷） 。我们在池塘B上的样本位置（图1和表1）是：（1）入流口（R流入池B的入流渠），（2）苍鹭岛（主湖西侧的浅水区）， 和（3）流出物（池塘B水流入另一条通向Par Pond的渠道）。 火塘是一个古老的农场池塘，它在SRS（20世纪50年代）的建造之前进行，并且没有来自现场操作的已知污染。 在临床和农业环境中广泛使用抗生素之前，SRS在20世纪50年代初对公众开放。 因此，从农业使用或废水处理设施中都没有向这些系统投入抗生素。

生物膜收集

漂浮的“框架”被部署在池塘B的三个位置和火池上的一个位置用于生物膜收集（参见上面的研究区域）。 每个站点都部署了两个框架，除了只接收一个框架的燃池外。 每个框架支持4，30 *30厘米的聚碳酸酯板材，它们悬浮在水柱的上部约35厘米处。 这些框架放置在每个地点的水中约30天（2016年5月27日）。 收集后，将每块聚碳酸酯板材放入单独的塑料袋中，储存在冰上并带至SREL。

放射性铯的生物膜分析

然后将生物膜材料从单独的平板刮到50ml离心管中（除去所有大碎片[例如叶/枝]）。 然后将样品冷冻干燥，装入5ml闪烁计数管并在Packard Cobra II auto-gamma计数器（型号Cobra II 5003; Packard Instruments Co.，Meriden，CT，USA）上计数。 该仪器每天进行校准。 对于每4个样品管我们包括一个空白（空管作为背景），并且每个管计数60分钟。 以Bq / g干重报告放射性铯水平。 池塘B生物膜的放射性铯浓度接近背景浓度。 来自燃池的四个平板中的三个小于背景/空白计数率，导致负放射性铯浓度的计算。 所有的数值都被用来计算均值和方差以消除偏差的估计（Gilbert和Kinnison，1981; Newman等，1989）。

生物膜细菌的收集和筛选

使用无菌手术刀，将每个生物膜板的一小部分（2times;2cm）刮入装有15mL无菌生理盐水（0.85％）的单个无菌瓶中。 将这些瓶放在冰上并在收集后1小时内返回实验室。 来自每个池塘的复制板的泥浆被复合。 从池B中三个位置的每一个收集的样品将单一浆料复合。通过涡旋将每个瓶中产生的浆液均化。

实验室实验

收集来自燃池和池塘B（每个位置1L的复合物）的水并过滤灭菌（0.2mm过滤器），并将每个水源倒入50mL到12个无菌125mL锥形瓶中。使用12个烧瓶中的四组作为对照，其中没有额外添加。每个来源的四个烧瓶加入Cu 2 SO 4溶液以获得0.1mM溶液，并且将来自每个来源的剩余四个烧瓶加入0.5mM Cu 2 SO 4。这些浓度用于支持SRS污染湿地中发现的浓度（范围2.0-50 ppb）。然后向24个烧瓶中接种1mL从燃池（12个烧瓶）或池塘B（12个烧瓶）的生物膜板收集的细菌浆液，并置于振荡培养器台上（60转/分钟），22℃下7天。在温育结束时，将来自每个烧瓶的50mL分散到半强度营养琼脂平板上。将平板在22℃温育过夜并从每个平板随机挑选5个菌落。菌落数/平板的平均值为50.因此获得了120个单独的分离物。通过在半强度营养琼脂平板上条纹铺板将这些菌落确定为纯培养物。挑出纯菌落并置于孢子体中，并保存在-80℃直至进一步筛选。

收集每个烧瓶中的水并在实验开始和结束时分析并用于确定Cu 2 SO 4的浓度。对于0.1和0.5mM烧瓶，初始浓度平均为0.09plusmn;0.03和0.43plusmn;0.04，终浓度为0.03plusmn;0.04和0.18plusmn;0.23。溶液中Cu2SO4的损失主要是由于吸附在烧瓶上（EPA，1993）。

抗菌药敏试验

按照制造商建议，使用M-H培养基，使用微量稀释的革兰氏阴性细菌到市售脱水96孔GN2F板上（Thermo Fisher Scientific，Cleveland，USA），以23种不同组合对23个抗生素的敏感性进行筛选。简而言之，从低温储存中回收分离物并在半强度营养培养基琼脂平板上划线并孵育24小时。从每个平板挑取2-3个菌落并在4mL的0.85％无菌盐水中乳化。然后通过加入细胞或用无菌盐水稀释测量光透射率（74.3％），将细胞浓度调节至0.5麦克法兰浊度标准。将所得溶液引入（30mL）到10mL阳离子调节的Mueller-Hinton培养基中，所述培养基用于接种测试板中的每个孔。 Sensititrereg;GN2F板包括九种主要结构抗生素（表2）。本分析中使用的所有浓度水平都是从最小值到最大值范围内的连续倍增。

统计分析

回收的分离物对Sensititrereg;GN2F板上的每种浓度的23种抗生素组合进行评分为抗性（1）或易感性（0）。在使用的120个分离物（2个池X 3个处理X 20个分离物）中，在从低温储存中复苏后都是可行的。基于来自Sensititrereg;GN2F面板的分数和在以下统计分析中使用的这些分布图，为每个分离物创建数值分布图。

如果分离物在96孔板上对抗生素浓度进展（加倍）特征浓度具有抗性，则其得到1分;如果是易感的，则测量变量为0.创建测量变量作为得分为1的进展中的倍增数量的比例。然后应用典型的方差稳定变换（反正弦平方根），导致23个变换的响应测量，其中较大值表示相应抗生素浓度较高时的AR。我们还计算了额外的回应，多AR特征评分（MAR）。 MAR是所有抗生素的总和 - 抗菌素浓度的最大值，而抗生素浓度是抗菌素的最大浓度。

将主成分分析（PCA）应用于23个变换响应，并且选择作为单维度的第一主成分（PC1）简化了测量。对MAR和PC1评分进行单因素方差分析，并通过线性对比法（Neter等，1996）和Tukey的诚实显着性差异（HSD）多重比较程序（Neter等，1996）对6种治疗组合进行统计学比较等，1996）。此外，使用判别函数分析（DFA）（Rencher和Christensen，2012）以图形方式描绘和比较预测的活菌株的治疗组分类与其实际治疗组的名称。所有统计分析均使用SAS Institute的JMP 11.0软件进行。

结果

池塘B系统中四个台站的放射性铯水平均显着高于火池中的水平（p lt;0.05），但没有统计学差异。 从池塘B中收集的生物膜具有介于1.25plusmn;0.41至2.39plusmn;0.70Bq / g生物膜之间的放射性铯水平（图2）。 燃池中的放射性铯平均含量为0.24plusmn;0.16 Bq / g生物膜。 正如方法部分所提到的，来自池B的用于微生物分析的生物膜样品汇集在一起。 因此，平均暴露于电离辐射为1.75plusmn;072Bq / g。

抗生素耐药性

每种筛选的抗生素至少有一些耐药菌株对一组抗生素抗性性相当高，而对其他，即使在最高浓度下，筛选出的几乎所有细菌分离株都是具有抗性的。

两个池塘系统内和之间抗生素抗性水平不同。 Sensititrereg;GN2F板含有23种组合的27种抗生素。对每种抗生素或抗生素组合进行单独分析，几乎没有提供这些微生物群体抗性广度的信息。我们对整套变换后的AR响应进行了PCA分析，从而将结果的维数从23个减少到2个维度，这些维度更容易以图形方式进行解释。前两个主成分（PC1和PC2）占样本变异的38.7％。每个分量是这些变换AR响应的线性组合，并作为响应间所有可能（23C2 = 253）成对相关的相关矩阵的特征向量获得。第一特征向量（PC1）评分（图3）之间的分离或变异主要是由于beta;-内酰胺AMP和PIP以及头孢菌素POD，P / T4，TANS和FUR的正反应载荷（即系数）。大的正或负载荷表明相应的抗生素对主成分评分的较大影响，以及对这些评分之间的差异的贡献大于其他抗生素。 PC2受氨基糖苷类TOB，AMI和GEN的负载荷影响最大，氟喹诺酮IMI，二氢叶酸还原酶抑制剂/磺胺SXT和头孢菌素FOX的负载荷最大（图3）。

大多数120株分离株对GAT和CIP敏感，只有2株来自燃池、1株来自池塘B对GAT有抗性，而且两个池塘中只有5株有CIP抗性。

每个池塘的对照烧瓶由暴露于每个池塘中的环境条件的细菌组成，而不添加Cu 2 SO 4。这些对照的第一主成分（PC1）得分的线性对比表明两个池塘之间没有统计学差异（p = 0.76）（图4）。

由于对照没有统计学差异，我们比较了0.1mM Cu2SO4和0.5mM Cu2SO4处理在整个池

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