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铅诱导小麦根的分化和超微结构变化
摘要：本研究的重点是探讨铅(Pb)诱导新陈代谢改变对小麦根的超微结构影响，以在结构水平建立Pb毒性综合征。 Pb(50-500mu;M)增强了丙二醛(脂质过氧化的指标)和过氧化氢含量以及电解质渗漏，从而表明活性氧诱导破坏小麦根的膜完整性和氧化应激。在Pb胁迫后超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性增强，而抗坏血酸和过氧化物酶的活性下降。
通过透射电子显微镜分析显示，Pb诱导的代谢显著破坏小麦根的超微结构。 Pb导致细胞壁变薄(50mu;M)，形成变形突起、折叠和细胞间隙，并出现病变和缺口(ge;250mu;MPb)，Pb沿着细胞壁沉积为黑色沉淀。在le;250mu;MPb，线粒体数量显著增加，而在ge;250mu;MPb时观察到形状的变化和结构的分解。 Pb减少核仁的大小并诱导泡沫的形成(250mu;M)，导致核仁在500mu;M下完全崩解。该研究得出结论，Pb抑制小麦根的生长，包括ROS介导的氧化损伤对于细胞膜超微结构的改变和线粒体以及核完整性的破坏。
关键词：Pb毒性 氧化性损伤 生化改变 根超微结构变化 细胞壁分裂 线粒体损伤
铅(Pb)是环境中最丰富的重金属污染物，通过各种人为活动释放。各种来源如汽车排气、工厂的烟囱、汽油和油漆中的添加剂、肥料和农药、金属电镀和精加工操作、矿石冶炼、蓄电池工业的废水和军事操作都大大增加了环境中的Pb浓度。释放后，Pb在土壤中很容易被吸收并积累，扰乱土壤生物学。作为植物生长和发育的非必需元素，Pb抑制种子发芽和幼苗生长，降解色素，甚至导致植物死亡。Pb胁迫诱导促氧化作用，并破坏植物中的各种生物化学和生理过程。这些包括膜渗透性，水状态和激素状态的变化，酶活性的抑制，矿物质营养中的紊乱，光合作用、蒸腾作用和DNA合成的减少，以及增强活性氧(ROS)的产生。在植物中Pb胁迫的主要影响包括阻碍根的生长，很大程度上是抑制根分生组织中的细胞分裂。其次，它诱导ROS介导的氧化应激，导致细胞损伤。
早期的研究报道了铅引起ROS生成和改变氧化代谢(酶和非酶)，在大蒜、荠菜 、鹰嘴豆、伊乐藻、紫花香薷、黄瓜、 豌豆、 小麦 、玉米中。 此外，一些研究表明Pb改变了普生轮藻节间段、葫芦藓原丝体 、艾葛以及豌豆根的超微结构。
然而，这些研究都没有尝试将Pb引起的超微结构变化与Pb诱导的氧化代谢的破坏相关联。因此，我们调查了Pb胁迫下小麦根的ROS介导的氧化损伤对细胞壁，线粒体和细胞核相关的超微结构变化的影响，以提供洞察 Pb毒性的综合征。
材料和方法
材料
小麦(T.aestivum L.)种子购买于种子商店。用次氯酸钠(0.1％，w/v)进行表面消毒，并在流动的蒸馏水下冲洗。Pb以硝酸铅的形式提供。用于生物化学检测和酶的化验的所有化学试剂都是分析试剂级的,购买于印度孟买的Sisco研究实验室和美国圣路易斯的Sigma Co公司。
铅处理
将二十粒小麦种子(25℃浸泡6小时)放置在盛有8.0ml 50或100或250或500mu;M Pb溶液或蒸馏水(作为对照)湿润的Whatman No.1滤纸的培养皿(直径，15cm)中。总之，有五种处理，包括对照(0，50，100，250和500mu;MPb)，每个处理重复五次。将所有处理物置于环境受控的生长室中，在20/10(plusmn;2)℃和74plusmn;2％相对湿度下，在240mu;mol mminus;2 sminus;1 PFD的14小时(0730-2130)光周期下。96小时后，测量生长种子的根长和芽长，并且使用原子吸收分光光度计分别测定根和茎组织中的Pb量。由于Pb胁迫的抑制作用在根中更显著，切下根，用10mM CaCl2洗涤，并储存在-40℃中用于超结构的研究和氧化损伤的评估。
铅的定量
将植物材料在70℃下烘干48小时，然后用HNO3 / HClO4(3:1，v/v)溶液处理。将消化的样品溶解在20ml去离子水中并在4℃下储存。使用EC4139原子吸收光谱仪分析消化物等分试样(2.0ml)的Pb。在建立峰面积基础上，针对一个已知的标准测量。
氧化损伤评价
根据脂质过氧化、过氧化氢(H2O2 )积累和相对电解质渗漏(REL)评价Pb诱导的氧化损伤。
脂质过氧化
根据丙二醛(MDA)含量评价脂质过氧化。因此，在预冷的研杵和研钵中加入100mg的根和5.0ml的0.1％三氯乙酸(TCA)并研磨均匀，并在4℃下以10000g离心20分钟。将1ml上清液与4.0ml 0.5％硫巴比妥酸在20％TCA中混合。将反应混合物在95℃下加热30分钟，在冰上冷却，再以10000g离心10分钟。在532nm测量上清液的吸光度，并在600nm下校正非特异性吸光度。 使用155 mMminus;1 cmminus;1 的消光系数(ε)计算MDA含量并表示为每克鲜重的纳摩尔。
H2O2 含量
简言之，在冰浴中用5.0ml的0.1％TCA提取根。将匀浆在12，000g下离心15分钟。 向0.5ml上清液中加入0.5ml磷酸盐(PO43minus; )缓冲液(pH7.0)和1.0ml 1M碘化钾，在390nm读取混合物的吸光度。使用ε0.0028 mu;Mminus;1 cmminus;1测定H2O2含量，并表示为每克鲜重的纳摩尔。
相对电解质渗漏
根据根组织中REL确定Pb对膜完整性的影响。25℃下在试管中加入200mg根和去离子水(5.0ml)反应2小时，测量外渗液的初始电导率(E1)。 将含有根的试管煮沸30分钟以释放所有电解质再冷却至25℃，并测量电导率(E2)。 REL计算为：REL =(E1/ E2)times;100
酶的提取
将根(250mg)在10.0ml冰冷的100mM PO43minus; 缓冲液(pH 7.0)中研匀。将匀浆通过三层纱布过滤，并在15，000g，4℃下离心30分钟。 将上清液的等分试样(0.5ml)用于蛋白质测量，使用牛血清白蛋白作为校准标准。将上清液储存在4℃下，直至用于测定超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，抗坏血酸过氧化物酶(APX)，愈创木酚过氧化物酶 (GPX)和谷胱甘肽还原酶(GR)的活性。
抗氧化酶活性测定
测定SOD的活性基于其抑制氮蓝四唑(NBT)光化学还原的能力。反应混合物(3.0ml)包括63mu;MNBT，13mM L-甲硫氨酸，0.1mM EDTA，13mu;M核黄素，0.05M碳酸钠和0.5ml酶提取物(或对照中的0.5ml蒸馏水)。将反应管放置在两个15W荧光灯下15分钟，并在黑暗中反应15分钟，在560nm处记录吸光度。 一个单位的SOD表示在25℃下其抑制NBT光化还原50％的量。
通过测量由于抗坏血酸氧化成脱氢抗坏血酸而在290nm(ε0.28mMminus;1 cmminus;1)处吸光度的降低来确定APX活性。 反应混合物(2.0ml)含有25mM PO43minus;缓冲液(pH7.0)，0.1mM EDTA，0.25mM抗坏血酸，1.0mM H2O2和0.2ml酶提取物。
根据Cakmak和Marschner采用的在240nm处的H2O2消失速率(ε039.4mM -1 cm -1)测量CAT的活性。反应混合物(2.0ml)含有25mM PO43minus;缓冲液(pH7.0)，10mM H2O2和0.2ml酶提取物。
通过测量由于愈创木酚氧化而在470nm处吸光度的增加(ε026.6mMminus;1 cmminus;1)来测定GPX活性。反应混合物(2.0ml)由25mM PO43minus;缓冲液(pH7.5)，0.05％愈创木酚，1.0mM H2O2，0.1mM EDTA和0.2ml酶提取物组成。
根据Foyer和Halliwell采用的NADPH在340nm(ε06.224mMminus;1 cmminus;1)的氧化来测定GR的活性。 反应混合物(2.0ml)由25mM PO43minus;缓冲液(pH7.0)，0.1mM EDTA，0.5mM GSSG(氧化的谷胱甘肽)，0.12mM NADPH和0.2ml酶提取物组成。
APX，GPX，CAT和GR的活性表示为酶单位(EU)/毫克蛋白质，其中1EU是25℃下每分钟分解1.0mu;M底物(抗坏血酸盐或愈创木酚或H2O2或NADPH)的酶量。
透射电子显微镜
在4℃下,根部的顶端部分(分裂区距离尖端约2mm)在100mM PO43minus; 缓冲液中含有7.2mM 2％多聚甲醛和2.5％戊二醛的固定剂中固定12小时。固定的根用100mM PO43minus; 缓冲液(pH7.2)冲洗三次。将样品在4℃下在四氧化锇(OsO4; 1％，w/v，100mM PO43minus; 缓冲液; pH = 7.2)中后固定2小时，随后用100mM PO43minus; 缓冲液冲洗以除去残留的OsO4。固定的样品通过一系列乙醇(30％，50％，70％和80％，v/v，每次30分钟)交换而脱水，包埋在CY212 环氧树脂(TAAB，UK)中65℃热固化聚合48小时。聚合嵌段用Ultracut UCT超薄切片机,切片为60-90nm。将切片安装在300目的Cu网格上，并用2％乙酸乙酯和碱性柠檬酸铅染色10分钟，然后用蒸馏水洗涤以增强对比。透射电子显微镜在70kV下观察染色网格中细胞的超微结构。照片用放大倍数为8900-14000的显微镜附带的MegaView III CCD(电荷耦合装置)照相机(FEI，Holland)数字获得。制备并观察包括对照细胞在内的每种处理的五个独立重复切片。
统计分析
实验在完全随机设计中进行，重复5次; 每个重复包括含有20个种子的单个培养皿。对于生化分析，有五个重复(独立)组织样本。通过单因素方差分析分析数据，然后使用Ple;0.05的Tukey事后检验比较平均值。
结论
Pb抑制小麦的幼苗生长
Pb胁迫导致小麦幼苗长度的显著减少(Ple;0.05)，并且抑制效应在根长度上更显著(表1;图1)。根长相对于响应100，250和500mu;MPb的对照分别降低21％，33％和40％。相比之下，在芽长中观察到16％和34％的下降，分别对应于250和500mu;MPb。(表1)
Pb在小麦根中积累
与抑制作用平行，在根中观察到大量的Pb积累(表2)。在50mu;M Pb时，根系累积了超过对照2.63倍的Pb，是芽的1.64倍。随着Pb浓度的增加，在根和茎组织中Pb累积持续增加。在100-500mu;MPb处理下，根累积2.95至6.83倍于对照的Pb，而枝条比对照中累积了1.88至2.39倍的Pb(表2)
Pb诱导小麦根中的脂质过氧化和H 2 O 2
Pb胁迫显著(Ple;0.05)增强MDA(脂质过氧化的指标)和H 2 O 2含量，从而表明小麦根中的氧化损伤(表3)。
MDA含量在50-500mu;MPb时比对照增加了1.34至2.00倍，它比在250和500mu;MPb下的对照分别增加约62％和102％(表3)。
与MDA含量平行，H 2 O 2的量在Pb胁迫时显著增加。H 2 O 2含量在50，100和500mu;MPb比对照分别增加了17％，40％和77％，(表3)。
表1 Pb处理4天后对小麦根长和芽长的影响
数据表示为平均值plusmn;SE。 一列中的不同字母表示在Ple;0.05应用Tukey检验的显著差异。
图1 图片显示了Pb对小麦幼苗生长的影响的照片。从左到右，幼苗从0(对照)，50，100，250和500mu;MPb胁迫的种子中出芽。
Pb增强小麦根的REL
Pb胁迫显著(Ple;0.05)加强了根的REL，从而表明膜完整性的破坏。REL在100和500mu;MPb下比对照分别增加35％和5
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