用于多重衍生工具的不同DOTA构建块的合成和适用性的改进外文翻译资料

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用于多重衍生工具的不同DOTA构建块的合成和适用性的改进

  1. Wauml;ngler,a B. Wauml;ngler,a M. Eisenhut,a U. Haberkornb and W. Mierb,*

aGerman Cancer Research Center, Radiopharmaceutical Chemistry, INF 280, 69120 Heidelberg, Germany

bUniverstiy Clinics of Heidelberg, Radiologische Klinik INF 400, Heidelberg, Germany

Received 7 September 2007; revised 12 November 2007; accepted 16 November 2007

Available online 22 November 2007

摘要：DOTA（1,4,7,10-四氮杂环二十二烷--N,N0,N00,N00-四乙酸）与大量金属离子形成极为稳定的配合物，是体内应用最为广泛和重要的螯合剂之一，用于癌症诊断和治疗。然而，许多已发表的DOTA衍生物的合成方法都很复杂，而且产率很低。本文报道了三叔丁基DOTA、三苄基DOTA和巯基DOTA的改进合成路线，并对新化合物三-4-硝基苄基-DOTA的合成进行了描述。此外，我们使用不同尺寸的氨基官能化PAMAM树状大分子测定了DOTA衍生物三叔丁基DOTA、巯基DOTA、三苄基DOTA、三-4-硝基苄基-DOTA、三烯丙基DOTA、DOTA PFP酯和DOTA PNP酯在多聚反应中的适用性。巯基DOTA被发现是与树枝状结构产生高度均匀DOTA多聚体的有效反应的最佳化合物。这种DOTA衍生物可以定量地与128-mer树状大分子结合。

  1. 简介

DOTA（1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸）是放射化学中最重要的螯合剂之一，它与大量的主族和过渡金属离子形成具有极高稳定常数的络合物。因此，DOTA是体内应用最常用的螯合剂，用于如癌症治疗和临床诊断。因此，它被引入生物分子，如肽和抗体，然后用放射性核素标记。此外，一些目前常用的MRI造影剂，如Gadovistreg;、ProHancereg;和Dotaremreg;是基于DOTA-gado-linium的复合物。Gadomer-17reg;是最近开发的一种MRI造影剂，它使用了一种多重DOTA衍生的树状大分子，与低分子量钆螯合物相比，具有更强的信号，因而显示出更长的保留时间和更好的可视化特性。

DOTA的这种多聚作用也有利于蛋白质结合物的合成，因为它能增强生物分子的特异活性。利用这些化合物，仅通过修饰载体分子的某些位点就可以获得更高的特异活性。由于DOTA是可供选择的螯合剂，因此需要能够方便合成生物分子多聚体衍生物的方案。然而，许多已发表的合成工艺复杂或产率低。

在目前的工作中，一些合成方案得到了改进，使DOTA合成子合成更快、更可靠。我们进一步研究了几种DOTA衍生物对多聚反应的适用性。PAMAM树状大分子被用作这些反应的模型化合物，并与不同的DOTA衍生物反应，以确定最适合用于多聚体分子定量衍生的合成子。

  1. 结果与讨论

2.1三叔丁基DOTA、三苄基-DOTA和巯基-DOTA的合成改进及新化合物三-4-硝基苄基-DOTA的合成。

与抗体或细胞因子等敏感生物分子的结合反应必须在温和的条件下进行。因此，可用于共轭反应的大量合成酶仅适用于生物相容性反应。对于树枝状结构的多重共轭反应，适用反应的范围更广，可使用大范围的活化螯合剂。DOTA衍生物在放射化学中具有高度的重要性，因此需要新方案来简化这些化合物的合成。

除了原位活化外，已知两种不同类型的DOTA衍生物：偶联后不需要脱保护的活性酯和使用额外偶联试剂反应并在偶联后脱保护的保护衍生物。许多已发表的DOTA-衍生物的合成方案都很复杂，纯化步骤很困难，或者产物产率很低。特别是对于在固相合成中引入DOTA的衍生物三叔丁基DOTA，本文介绍了几种合成方法。然而，这些方法并不注重合成的关键点：第一个中间产物（1,4,7,10-四氮杂-环十二烷基-1-基）-乙酸苄基酯（1）的反应和纯化过程中所需的低温，以及合成的所有步骤中的快速纯化（方案1）。

方案1:tris-tBu-DOTA的合成。试剂和条件：（a）溴乙酸苄酯，CHCl3，rt，3h，86%；（b）溴乙酸叔丁酯，K2CO3，乙腈，rt，2-5h，67%；（c）Pd/c，H2，THF/MeOH 1:1，rt，2-8h，71%。

较高的反应温度和与硅胶色谱材料的长时间孵育导致分子内环的形成或产物的碎裂，需要复杂的纯化步骤并降低合成产率。

所述硫醇DOTA的合成方案从三叔丁基DOTA开始，三叔丁基DOTA要么昂贵，要么必须根据上述多步骤方案合成。此外，在TFA中长时间培养期间产生的叔丁基基团和碎片产物的缓慢脱保护导致产量低下（图1）。

图1:16h后S-三苯基-巯基-三-tBu-DOTA与浓缩TFA脱保护反应的色谱图（紧凑线）和离析物（虚线）。洗脱梯度：0–100%MeCN 0.1%TFA ，5分钟。

从DOTA开始，直接与S-三酰保护的巯基乙醇反应，然后与一定浓度的TFA脱保护（方案2），从而在最终脱保护步骤中产生更少的副产物，从而简化合成（图2）。

方案2：以DOTA为起始原料合成巯基DOTA。试剂和条件：（a）S-三苯基-巯基-乙醇胺三氟乙酸，DCC，水/MeCN 1:1，吡啶，rt，10h，23%；（b）TIS，TFA，rt，5min，56%。

图2:洗脱5min后，S-三苯基-巯基乙基氨基-DOTA与浓缩TFA脱保护反应的色谱图渐变：5分钟内加入0-100%MeCN 0.1%TFA（请注意，产品在214 nm处不含强吸附发色团）。

三苄基DOTA是一种有价值的DOTA合成子，特别是当需要对偶联的DOTA进行温和的脱保护步骤时。在合成的第一步中，可以使用烯丙基保护的乙酸衍生物而不是叔丁基保护的衍生物来促进这种复合物的合成。以四-（三苯基膦）-钯为催化剂可以容易地去除烯丙基保护基（方案3）。

方案3：三苄基DOTA和三-4-硝基苄基-DOTA的合成。试剂和条件：（a）氯乙酸烯丙酯，CHCl3，1h，4℃，6h，rt，66%；（b）溴乙酸苄酯，K2CO3，MeCN，rt，10h，44%；（c）四-（三苯基膦）-钯，吗啉，CH2Cl2，rt，3h，71%；（d）4-溴乙酸硝基苄酯，K2CO3，MeCN，rt，2h，78%；（e）四-（三苯基膦）-钯，吗啉，CH2Cl2，rt，1h，27%。

这是有利的，因为在合成的最后一步中，苄基保护基对叔丁基与12 N HCl/1，4-二氧六环1:1所需的苛刻脱保护条件不是惰性的，从而导致产物碎裂和低反应产率（图3）。

图3:10min（虚线）和12h（紧凑线）后用12N HCl/二氧六环1:1分解三苄基DOTA。洗脱梯度：5分钟内0-100%MeCN 0.1%TFA。

然而，使用上述合成方法，在最后的脱保护步骤中可以观察到更少的副产物（图4）。

图4:以四-（三苯基膦）-钯为催化剂，7最终脱保护步骤3h后的色谱图。洗脱梯度：5分钟0–100%MeCN 0.1%TFA 。

此外，还合成了一种新的DOTA衍生物三-4-硝基苄基-DOTA。由于4-硝基-苄基在有机溶剂中很容易被TBAF（四丁基氟化铵）裂解，这种化合物在非常温和的条件下应该是可脱保护的，因此应该适合于用DOTA衍生敏感分子。该化合物经三步合成，产率适中。然而，由于它的灵敏度很高，因此不能成功地用于耦合实验。

2.2不同DOTA衍生物对多聚反应的适用性

对于某些应用，需要在一个分子中引入大量的螯合剂。例如，这有利于合成每分子需要大量金属离子（例如钆）的MRI造影剂或放射性示踪剂，以实现高对比度或实现放射性标记化合物的高比活性。

因此，我们研究了几种DOTA衍生物在多聚反应中的偶联率。对于多聚反应，PAMAM树状大分子含有一个带有末端保护巯基的聚乙二醇连接体和1到128个胺官能团。这些树状大分子与三叔丁基DOTA、巯基DOTA、三苄基-DOTA，三-4-硝基苄基-DOTA，三烯丙基-DOTA、DOTA- PFP酯和DOTA-PNP酯反应（方案4）。

方案4:含有1–128个胺官能团的PAMAM树状大分子与不同DOTA衍生物的反应。试剂和条件：（a） 三-tBu DOTA，PyBOP，DIPEA，DMF，rt，3h，70–83%；（b）三烯丙基DOTA，PyBOP，DIPEA，DMF，rt，2.5h，76–84%；（c）三苄基DOTA，PyBOP，DIPEA，DMF，rt，5h，未分离的产品；（d）DOTA PFP酯或DOTA PNP酯，DIPEA，DMF，rt，1h或10h，未分离的产物（e）马来酰亚胺己酸，PyBOP，DIPEA，DMF，rt，40min，29–84%；（f）硫醇DOTA，PBS（0.05 M P，0.15 M NaCl，pH 7.2），rt，10min，65-91%

这些实验表明，三叔丁基-DOTA和三烯丙基-DOTA可以偶联到含有一到八个氨基功能的树状大分子上，从而以良好的产率得到均匀的产物（表1和图5）。然而，DOTA多聚体随后的脱保护步骤是有问题的。在三叔丁基-DOTA多聚体的情况下，用浓缩的TFA脱保护会在10min内引起树状大分子的聚乙二醇连接物的碎裂。此外，脱保护反应非常缓慢，由于保护基团的不完全去除而导致产物不均匀。在三烯丙基DOTA多聚体的情况下，脱保护反应在短时间内是定量的，但会产生难以纯化的反应混合物，因为催化剂四-（三苯基-膦）-钯会产生非常高的UV信号，从而阻止产物的HPLC纯化。

DOTA的活性酯应该是多聚反应的有利组成部分，因为它们可以直接偶联，而不需要使用额外的偶联剂，而且随后的脱保护步骤是不必要的。DOTA-PFP酯和DOTA-PNP酯与含有1～8个氨基官能团的树状大分子反应。可以观察到，活性酯与树状大分子的氨基发生了有效的反应，产生了不均匀的产物，即使在每个氨基官能团的活性酯含量高达5当量的情况下（表1）。然而，可以看出DOTA-PFP酯比DOTA-PNP酯表现出更高的反应活性（表1）。

三苄基DOTA在多聚反应中表现出与DOTA活性酯类似的偶合性质，并且由于偶合产率不足而产生不均匀产物（表1和图5）。

与此相反，巯基DOTA可在den-drimer氨基与马来酰亚胺己酸之前衍生化后定量引入（表1）。这种方法产生的DOTA多聚体不需要额外的脱保护步骤，因此也非常适合生物分子的衍生化。此外，偶联反应在几分钟内完成，产物可以获得高均匀性（图5）。

表1:HPLC法测定不同DOTA衍生物与含有不同数目氨基功能的树状大分子的偶联率

图5:含8个氨基官能团的树枝状大分子与三tBu-DOTA（A）、三苄基DOTA衍生反应的色谱图（B） 和硫醇DOTA（C）。洗脱梯度： 5分钟0–100%MeCN 0.1%TFA。

总之，三叔丁基DOTA和三烯丙基DOTA甚至可以定量地偶联到大量的氨基，但显示出不利的脱保护特性。由于脱保护催化剂产生的高紫外信号，三烯丙基DOTA特别适合于固相化学。三苄基DOTA、DOTA-PFP酯和DOTA-PNP酯在与大量氨基偶联时表现出不足的反应性，因此不适合于多聚反应，尽管活性酯在与生物分子偶联时具有良好的效果。巯基DOTA与马来酰亚胺衍生物树枝状大分子发生定量反应，产物收率高，均一性好。因此，巯基DOTA是产生DOTA多聚体的合适化合物，适用于提供高对比度的分子成像。

  1. 结论

综上所述，我们可以改进三叔丁基DOTA、三苄基DOTA和硫醇DOTA的合成路线，建立新化合物三-4-硝基苄基DOTA的合成方法。

我们进一步确定了DOTA衍生物三叔丁基-DOTA、巯基DOTA、三-苄基DOTA、三-4-硝基苄基-DOTA、三烯丙基-DOTA、DOTA PFP酯和DOTA PNP酯对不同尺寸PAMAM树状大分子的多聚反应的适用性。结果表明，三叔丁基DOTA和三烯丙基DOTA可以进行多聚反应，得到均匀的偶联产物。然而，产物的脱保护存在问题，表明三叔丁基DOTA和三烯丙基DOTA的应用分别限于非敏感分子和固相合成。三苄基DOTA、DOTA-PNP酯和DOTA-PFP酯对产生异构产物的树枝状核心分子反应性低，因此不适合多聚反应。

然而，我们发现巯基DOTA具有优异的偶联性能，适用于树突状分子的多次引入：它可以定量引入，产生高度均匀的DOTA多聚体，偶联后不需要脱保护。因此，巯基DOTA适合于多聚体衍生物的衍生化，并且所获得的DOTA多聚体在引入载体分子时可以在分子成像中产生高对比度。

  1. 实验

4.1概述

所有商用化学品均为分析纯，使用前无需进一步纯化。

使用具有Chromolithreg;性能的安捷伦1100reg;系统（RP-18e，100–4.6 mm，德国默克）柱进行分析。使用配备可变SPD 6-a紫外检测器和C-R5A积分器（均为Shimadzu，Duisburg，Germering，德国）的Gyncotech P-580系统进行半制备HPLC纯化。使用的色谱柱是Chromolithreg;（RP-18e，100–10 mm，德国默克公司）。

在Kratos分析紧凑型MALDI-III系统上

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