包埋于海藻酸盐-果胶微凝胶的唾液乳杆菌LI01对D-半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤的改善作用外文翻译资料

 2022-12-28 03:12

包埋于海藻酸盐-果胶微凝胶的唾液乳杆菌LI01对D-半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤的改善作用

Aoxiang Zhuge， Bo Li， Yin Yuan

摘要：急性肝衰竭是一种高死亡率的临床急症。越来越多的证据表明，肠道菌群参与了肝损伤的进程，因此基于改变肠道菌群的预防性治疗引起了人们的极大兴趣。先前的研究表明唾液乳杆菌LI01可以减轻肝损伤，但在胃肠道恶劣环境中作用会减弱。本研究以海藻酸盐-果胶（AP）微凝胶为载体，研究LI01的包埋体系。在长期储存和热处理以及模拟胃肠液（SGF或SIF）和胆盐溶液中，包埋可显著提高益生菌的活性。益生菌预处理后，注射D-半乳糖胺（D-GaIN）诱导Sprague-Dawley（SD）大鼠产生急性肝损伤。评估肝脏和肠道屏障功能、细胞因子、肝脏和肠道组织学、细菌移位和肠道菌群。与未包埋的益生菌预处理相比，经包埋的LI01可更有效地上调肝脏抗炎细胞因子IL-10和TLR-3，恢复肠道屏障生物标志物Claudin-1和MUC2的表达，并减轻粘膜超微结构的破坏。AP-LI01微凝胶预处理改变了微生物群落，降低了致病类群瘤胃梭状芽孢杆菌、多尔氏菌属和瘤胃球菌科_UCG-004的丰度，增加了可产生短链脂肪酸的有益类群瘤胃球菌科_UCG-014、真杆菌和普雷沃菌_1。这些结果表明，包埋于AP的LI01可以通过减轻炎症和恢复肠屏障功能来提高生存能力和减轻肝损伤。这些有益的影响可能是由于肠道菌群的改变。这些发现为包埋技术和预防肝衰竭提供了新的见解。

关键词：包埋、唾液乳杆菌、急性肝损伤、肠屏障、肠道菌群

引言

急性肝衰竭（ALF）是由药物滥用、肝炎病毒感染、酗酒和自身免疫因素引起的一种罕见但危及生命的临床急症。20%病例的病因尚不清楚（Rifaie和Saner，2020）。ALF最初表现为肝功能急剧下降，随后出现肝性脑病、颅内压增高、凝血功能障碍，最终出现多器官并发症（Bernal等，2015）。60% - 80%的ALF患者存在死亡的倾向（Wlodzimirow等，2012）。肝移植90天后死亡率下降约35%（Mallick等，2020）。ALF病例的缺乏限制了随机对照试验的实施，从而阻碍了治疗方法的研究（Rifaie和Saner，2020）。为了解决这个问题，尽管将模型转化为人类疾病方面仍然存在巨大的差距，但是实验模型对于模拟人类肝损伤中的若干情况以及测试新的治疗干预措施的有效性至关重要（McGill等，2014）。ALF动物模型的主要标准包括可逆性、可重复性、肝衰竭死亡、治疗窗、适当的动物体型以及对人的最小危害（Terblanche和Hickman，1991）。D-半乳糖胺（D-GaIN）是一种代表尿苷三磷酸（UTP）的多胺，可抑制生物合成，从而导致肝细胞变性坏死，已被广泛应用于ALF的建模中（Maes等，2016）。因此，我们以半乳糖胺/内毒素（Gal/ET）建立的动物模型来研究凋亡和继发性坏死，并研究TNF-alpha;介导的细胞凋亡信号转导机制和炎症介导因子在人类急性肝损伤中的作用。

越来越多的的证据表明，肠道微生物群和疾病、精神病、新陈代谢、肿瘤发生、自身免疫和消化之间存在密切关联（Ticinesi等，2018；Patterson等，2016；Brennan和Garrett，2016；Thaiss等，2016；Ni等，2017），重点研究肾肠、脑肠、肺肠和肝肠（Yang等，2018；Loverdos等，2019；Minemura和Shimizu，2015）。肝损伤导致肠屏障破坏，随后过度生长的肠道细菌穿透弱化的肠屏障并允许细菌运输。这些细菌的内毒素和其他产物可直接引发内毒素血症和系统性炎症（Woodhouse等，2018），急性和慢性肝衰竭患者的总体微生物多样性和丰富度都在减少，类杆菌科、瘤胃球菌科和腊肠螺科的丰度较低，巴氏杆菌科、链球菌科和肠球菌科的丰度较高（Chen等，2015）。鼠李糖乳杆菌ATCC 53103可减少ALF患者的细菌移位并改善肝功能的恶化（Adawi等，2001）。

FAO（联合国粮食及农业组织）将益生菌定义为“当给予足够剂量时，会给宿主带来健康益处的活的微生物”，这突出了益生菌的本质（微生物、可存活和有益健康）（Hill等人，2014）。例如，乳酸菌可利用碳水化合物发酵并产生乳酸作为主要终产物，长期以来一直用于乳制品中（Goldstein等，2015）。除了商业用途外，乳酸杆菌菌株在人类健康方面显示出巨大的潜力。鼠李糖乳杆菌GG株被证明能显著降低小儿肥胖症相关肝病的转氨酶（Vajro等，2011）。Hsieh等（2020）报道，唾液乳杆菌AP-32和罗伊氏乳杆菌GL-104能够改善db/db小鼠的糖耐量和血脂水平，并减轻糖尿病介导的肝肾损伤。然而，口服益生菌面临几个挑战：（1）存在于胃肠道（GIT）中的化学性、酸性或碱性消化液、酶和胆盐可能会降低其活性；（2）胃肠道传输时间短，可能会限制益生菌的滞留、粘膜粘附和吸收（Anselmo等，2016）。包埋技术是克服这些局限性的一种手段。微胶囊由多聚糖类化合物（主要是海藻酸盐、树胶、壳聚糖和淀粉）、蛋白质和脂肪组成，用于在商业生产、储存和口服过程中保护益生菌免受氧气、冷冻和酸/碱条件的影响（Terpou等，2019）。

唾液乳杆菌LI01是从健康的志愿者粪便中分离得到的，已显示该菌种能够改善D-GaIN诱导的大鼠急性肝损伤后的肝功能，减少细菌移位并增加微生物多样性且无副作用报告（Lv等，2014）。但是，其基本机制仍不清楚。 在本研究中，LI01的包埋系统用于增加对消化液、酶、胆盐和热的抵抗力。 随后，在肝衰竭大鼠模型上进行微凝胶评估，以检查LI01的作用，并确定对肝损伤有益作用的机制。

材料与方法

材料

DeMann、Regosa、Sharpe（MRS）肉汤、脑浸液（BHI）肉汤和琼脂均购自Oxoid公司（Oxoid Ltd.，Basingstoke，Hampshire，England）。海藻酸钠、果胶、氯化钙、氯化钠、大豆油、胃蛋白酶、胰酶、胆盐和所有其他材料均购自Sigma-Aldrich公司（St. Louis，MO，USA）。酶储存在4℃下，使用前通过0.45mu;m过滤器过滤。使用纳米纯金刚石（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）制备去离子水。

LI01菌株及培养条件

唾液乳杆菌LI01（CGMCC 7045）最初是从健康的志愿者粪便中分离出来的。 LI01储备液在-80℃条件下存储在含有25%甘油的MRS肉汤中，并在新鲜的REM肉汤中，在10%H2，10%CO2和80%N2（AW300SG厌氧工作站；Electrotek，Cookley，Kidderminster，England）的空气中37℃下培养24小时。将培养物在4℃下以3000 rpm离心15分钟，用无菌医用生理盐水漂洗两次以收获细胞，然后以1010个菌落为单位CFU/ml的最终浓度重新悬浮以供进一步使用。

包埋LI01

将1ml悬浮液（含1010 CFU）分散于9ml海藻酸钠（1.0%，w/v）和果胶（1.0%，w/v）的混合物中制备LI01悬浮液。将悬浮液缓慢喷洒到50ml大豆油（含0.2%吐温-80）中，搅拌10分钟，形成水/油（W/O）乳液。然后沿着烧瓶壁倒入氯化钙溶液（5.0%，W/v）以打破乳液并进一步硬化30分钟。整个过程在室温下恒定搅拌（550 rpm）下进行。微凝胶溶液以1000rpm离心10min后，收集小球并用生理盐水冲洗3次。将富含益生菌的湿微凝胶在minus;80°C下冷冻过夜，为冻干作准备（Virtis AdVantage EL-85；SP Scientific，Warminster，PA，USA）。立即对海藻酸盐-果胶LI01微凝胶进行包埋率和体外存活率测定，并在4°C下储存长达4周以进行储存时间实验，或在minus;20°C下储存，以供每日大鼠灌胃。

粒径

用LPSA（S3500，Microtrac Inc.，Montgomeryville和York，PA，USA）分别测定湿的和冻干的益生菌样品的粒径。

光学显微镜

将湿的微凝胶以适当的比例用盐溶液稀释并通过光学显微镜观察，使用数码相机系统（CX31-12I02，OLYMPUS，Tokyo， Japan）记录图像。将一滴湿微凝胶在37℃的条件下添加到5 ml 10%柠檬酸钠溶液中10分钟以完全破坏微凝胶，观察释放的细菌。

扫描电子显微镜

将冻干的微胶囊放置在铝标本上，并通过直流（DC）溅射在其表面镀上一层金薄层。通过日立SU-8010扫描电子显微镜（SEM）（Hitachi，Tokyo，Japan）在不同放大倍数下观察镀金样品。

益生菌在长期存储和热处理过程中的活性

在4℃下储存0、7、14、21和28天后，将1毫升游离或包埋的LI01样品与9ml柠檬酸钠混合。涡旋混合后，将样品置于37℃的摇床上，直到微凝胶完全崩解。通过平板计数法在MRS琼脂上计算活细菌，一式三份。

同样，通过将游离的LI01和包埋的LI01放在63℃的培养箱中15或30分钟来进行耐热处理。热处理后，将混合物置于冰上以迅速平衡至4℃，并按上述方法测定活菌。

模拟胃肠道环境中微胶囊的抗失活能力

根据美国药典（USP，https://www.usp.org）制备了模拟胃液（SGF）或模拟肠液（SIF）来模拟GIT中的消化液。制备1升的SGF，其中包含氯化钠（2 g），胃蛋白酶（3.2 g），盐酸（7 ml）和去离子水，并将pH调节至1.2。制备肠溶原液，其中包含磷酸氢二钾（6.8 g），0.2 M NaOH（77 ml）和去离子水（500 ml）。然后，我们将胰酶（10 g）添加到储备肠溶液中，并使用0.2 M HCl或NaOH将pH调节至6.8，最后用去离子水稀释至1升，以获得SIF。将每1ml样品分别添加到9ml SGF、SIF或2%胆盐溶液中，并保存在37℃恒温摇床中。在0、10、20、30、40、50和60分钟时测量细菌活力。

急性肝损伤模型及治疗

30只雄性无特异性且无致病菌的SD大鼠（7~8周）随机分为5组：对照组用生理盐水处理（NC组，n=6）、D -GaIN诱导的肝衰竭组分别用生理盐水处理（ PC组，n = 6），空海藻酸盐-果胶微凝胶（AP组，n = 6），唾液乳杆菌LI01（LI01组，n = 6），或海藻酸盐-果胶LI01微凝胶（AP-LI01组，n = 6）。治疗组（AP组、LI01组、AP-LI01组）用游离LI01或LI01微凝胶悬浮液定容至1ml（2times;109CFU/ml）灌胃，同时NC组和PC组用等量生理盐水灌胃，每日1次，连续7天。将AP组设为治疗对照组，观察海藻酸盐和果胶的潜在作用。所有大鼠按组分别关在笼子里（一笼三只），且可自由获得标准食物和清水，并保持在室温（20–22℃）下，可控制明/暗周期为12/12-h。各组大鼠于第8天皮下注射1100mg/kg的D-GaIN（G0500，Sigma，Saint-Louis，MO，USA）诱导急性肝损伤，而NC组给予等量生理盐水。将大鼠麻醉并在注射D-GaIN 24小时后处死以收集实验样品。

所有程序均由浙江大学医学院第一附属医院动物护理委员会负责。

肝功能生化参数

采集上腔静脉血，室温放置30min，然后3000rpm离心10min后采集血清。丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）由FUJI DRI-CHEM 4000ie（FUJIFILM，

Tokyo，Japan）按照制造商的规程进行了测量。

细菌移位评估

分别采集上腔静脉和腹主动脉的血液，以及左肝叶、肾脏和肠系膜淋巴结（MLNs）的样本。称取样品，与盐水按1:9 w/v混合，并在高压灭菌的匀浆机中均质。将样品悬浮液置于37℃的BHI琼脂上有氧或厌氧培养48小时。如果培养为阳性，细菌移位率计算为n/N作为记录的样本数量。

内毒素和脂多糖结合蛋白测定

大鼠内毒素ELISA试剂盒（YS-E90951; Yansheng Co.Ltd.，中国上海）和大鼠脂多糖结合蛋白（LBP）ELISA试剂盒（RA20207; Bioswamp Co.Ltd.，中国武汉）分别用于定量测定血浆中内毒素和LBP的水平。

组织病理学分析和免疫荧光染色

左肝叶和回肠末端用10%甲醛固定24h后石蜡包埋，将石蜡包埋的组织切成4mu;m厚的切片，并用苏木精-伊红（Hamp;E）和阿尔新蓝染色。

组织学评分的评估委托给对实验设计不了解的病理学家。根据组织学活动指数，肝组织病理学评分包括小叶内变性和局灶性坏死（得分0-1或3-4）和门静脉炎症（得分0-1或3-4），反映了急性肝损伤（Knodell等，1981）。根据Chiu等（1970）的研究评估肠粘膜病变。评分0定义为正常肠粘膜，评分1代表绒毛尖端上皮下层Gruen Hagen间隙的发育；评分2时，该间隙更大。在评分3中大量上皮细胞会从绒毛的一侧脱落。评分4时绒毛的上皮细胞脱落，而绒毛的脱落被评定为5分。

末端回肠部分脱蜡，再水化，并用3%H202处理。将标本与Claudin 1抗体（1：500，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）在4℃下孵育过夜，并在室温下用异硫氰酸荧光素（FITC）结合山羊抗兔（1:500，Beyotime，Shanghai，China）染色1h。用PBS洗涤两次后，切片用固定剂（B

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

英语原文共 19 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[270841]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word

原文和译文剩余内容已隐藏，您需要先支付 30元 才能查看原文和译文全部内容！立即支付

以上是毕业论文外文翻译，课题毕业论文、任务书、文献综述、开题报告、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。

您可能感兴趣的文章