基于完整糖肽串联亲和富集和质谱检测的侵袭性前列腺癌细胞系位点特异性岩藻糖基化糖蛋白分析外文翻译资料

 2022-12-28 03:12

基于完整糖肽串联亲和富集和质谱检测的侵袭性前列腺癌细胞系位点特异性岩藻糖基化糖蛋白分析

摘要：岩藻糖基化(Fuc)的糖蛋白在调节蛋白功能中起重要作用，并与包括前列腺癌(Pca)在内的多种癌症的发生有关。因此，近年来Fuc糖蛋白在分析领域受到越来越多的关注。在此，我们建立了一种基于凝集素亲和富集完整糖肽再使用质谱分析的方法，以评估各种功能结合凝集素的特异性，这些凝集素用于非侵袭性(NAG)和侵袭性(AG)Pca细胞系的糖基特异性Fuc分析。对单独或联合使用凝集素(LCA、PSA、AAL、LTL、UEA I和AOL)和MAX萃取柱对Fuc糖肽的富集特异性进行评估。结果表明，与MAX富集相比，凝集素富集显著提高了岩藻糖基化糖肽占总糖肽的比例。此外，与单独使用凝集素富集相比，串联使用凝集素和MAX增加了Fuc糖肽的鉴定数量，并且与AAL、LTL和UEA I相比，LCA、PSA和AOL具有更强的结合能力。同时，LCA和PSA特异性结合到核心Fuc，AOL、AAL和UEA I则结合到核心Fuc和分支Fuc。采用优化的LCA和MAX串联富集(LCA-MAX)方法，对2株NAG细胞和2株AG Pca细胞系的Fuc糖蛋白质组进行了检测。通过串联质谱标记(TMT)和纳米液相色谱质谱法(nanoLC MS/MS)分析，从252个Fuc蛋白中总共鉴定和定量了973个完整的Fuc糖肽。进一步的数据分析表明，51个Fuc糖肽在AG细胞系中的表达是在NAG细胞中的2倍以上。分析蛋白质核心岩藻糖基化有助于我们了解AG Pca的侵袭活性，利于AG Pca诊断方法的发展。

  1. 引文

蛋白质糖基化是蛋白质功能修饰的重要方式之一，在细胞粘附、受体激活、肿瘤侵袭、转移和炎症反应等多种细胞过程中发挥着重要作用[1-4]。岩藻糖基化(Fuc)，尤其是核心Fuc分支，是最常见的基于糖基的修饰之一，据报道参与了如癌症和炎症等疾病的发生[5]。研究显示，在正常人，良性肿瘤、癌症和其他疾病患者的生物样本中Fuc水平存在差异[6-17]。例如，与健康志愿者(HV)相比，慢性胰腺炎(CP)患者的血清Fuc结合珠蛋白水平显著升高，而胰腺导管腺癌(PDAC)患者的血清Fuc结合珠蛋白水平进一步升高。此外，CP患者的血清核心Fuc结合珠蛋白水平明显高于HV和PDAC患者[13]。此外，与肝细胞癌患者或健康对照组相比，肝硬化患者血清Fuc胎球蛋白A水平较低[14]。由于Fuc在疾病中存在异常，核心Fuc糖蛋白已被用作临床诊断的生物标志物，正如核心Fuc糖形式的alpha;胎蛋白(AFP-L3)获得FDA批准作为肝细胞性肝癌的诊断生物标志物所证明的那样[18]。

由于Fuc糖蛋白的生物学意义，Fuc糖蛋白的研究越来越受到分析领域的重视。Fuc糖蛋白分析主要有两种方式: (1)采用ELISA、蛋白质/凝集素印迹或质谱(MS)测定靶向Fuc蛋白[6,13,14,16,19,20];(2)采用MS分析进行大规模Fuc糖蛋白组学分析[8,10,18,21-24]。后者可能更全面，因为它有助于理解与肿瘤发生和转移相关的潜在机制，以及发现新的潜在的生物标志物用于早期临床诊断。目前，大规模的Fuc糖蛋白组学分析通常采用分而治之的方法，即分别对多糖或去糖基化肽进行分析，利用酶或化学方法选择性地切割多糖或糖蛋白[8,10,18,20-25]。然而，这种方法的一个主要缺点是，连接糖基化位点和各自的糖基结构的信息丢失了，并且一些方面不能被检测，比如在特定糖基上的糖基微观异质性[26]。因此，通过直接分析完整的糖蛋白来分析大规模糖蛋白体(包括Fuc)的方法是必要的。

与胰蛋白酶消化产生的非糖基化肽和非Fuc糖肽相比，Fuc 糖肽的丰度相对较低。进一步的混杂分析时，由于在质谱法分析过程中非Fuc肽的共洗脱可以掩盖Fuc糖肽的光谱，因此Fuc糖肽的特异性富集是首选。凝集素是一种能识别特异性糖链的蛋白质，广泛用于选择性地富集糖基化蛋白/多肽，从而分析特异性糖形态[27,28]。凝集素在蛋白质水平的富集可以捕获凝集素结合的糖蛋白及其相关蛋白，而在肽水平的凝集素富集一般可以在特定的糖基化位点富集特异性的糖蛋白[29,30]。迄今为止，透镜凝集素(Lens culinaris agglutinin，LCA，LCH)在大规模Fuc糖蛋白质组分析中常被用来丰富Fuc糖肽[8,10,18,21-24,31]。除LCA外，其他凝集素，包括豌豆凝集素(PSA) [32]、橙黄凝集素(AAL) [33]、翅荚百脉根凝集素(LTL) [34]、花粉凝集素(UEA I) [35]、米曲菌凝集素(AOL) [36]、三角凝集素(BTL) [37]、匍枝根霉凝集素(RSL) [38]、凝集素头孢霉凝集素(CSL)[39]和花粉凝集素(PhoSL)[32]都被报道具有岩藻特异性。凝集素LCA、PSA、AAL和AOL的特异性已通过前沿亲和层析[40,41]进行评估，而一种测定红细胞凝集抑制程度以评估凝集素特异性的方法被用于评估LTL和UEA I的特异性[42]。然而，这些凝集素通过其多糖结构富集完整糖肽时的特异性还有待评价。

在美国乃至世界各地，前列腺癌(Pca)都是男性最常见的癌症[43]。前列腺特异性抗原是一种糖蛋白，具有N-连锁糖基化位点，是FDA批准的前列腺癌筛查血清生物标志物，用于Pca高危人群的检测[44,45]。然而，血清前列腺特异性抗原浓度对前列腺癌诊断敏感性和特异性较低，不能可靠区分非侵袭性(NAG)和侵袭性(AG)Pca肿瘤类型，这可能导致不必要的活检程序[46-48]。近年来，人们致力于寻找新的生物标志物，以改进Pca的检测，特别是对蛋白糖体异常表达的鉴定[16,17,49-53]。我们之前已经报道过alpha;(1,6)岩藻糖基转移酶(FUT8)的表达，这是一种催化GDP-岩藻糖转移到N连接型复合糖肽的酶，在前列腺癌组织样本以及侵袭性Pca细胞系PC3中，侵袭性比LNCaP细胞弱[54]。此外，使用一种基于凝集素AAL的免疫分析法检测Pca患者血清样本糖蛋白中的Fuc糖蛋白，可以发现，与NAG Pca相比，AG Pca中Fuc前列腺特异性抗原的比例显著增加[55]。在另一项研究中，我们检验了总体蛋白和糖蛋白表达谱的差异，发现相对于LNCaP细胞，PC3细胞中Fuc糖肽类的表达增加[56]。总之，这些结果表明，对AG Pca和NAG Pca中Fuc糖蛋白组的系统分析可以识别Fuc糖蛋白表达的差异，并有助于开发适用的糖蛋白标记物，提高对不同层次的Pca患者的特异性和敏感性。

在这项研究中，我们旨在建立一种方法来评价各种Fuc结合凝集素的特异性，这种特异性用于进行Pca细胞糖基特异性岩藻糖基化分析时富集完整的Fuc糖肽。为此，我们检测了四种广泛研究的代表NAG和AG状态的前列腺癌进展的细胞系:LNCaP和LAPC4（雄激素依赖性），以及PC3和DU145（雄激素非依赖性）[57]。我们首先使用六种凝集素(LCA、PSA、AAL、LTL、UEA I和AOL)和MAX萃取柱分别或串联评估完整Fuc糖肽类的富集特性，然后进行纳米液相色谱质谱(nanoLC MS/MS)分析。为了鉴定Fuc完整的糖肽类，并获得Fuc糖肽类特异性的糖链信息，我们使用了内部开发的糖肽类分析软件GPQuest[58]。然后结合串联质谱标记(TMT)定量分析，对4个Pca细胞系的Fuc糖蛋白组进行分析（见图1）。

图1 富集方法的优化和6种Fuc结合凝集素特异性的比较(a)，以及使用LCA-MAX富集法从4个Pca细胞系中大规模鉴定和定量完整Fuc糖肽类(b)。

  1. 材料与方法

化学药品和试剂。琼脂糖结合凝集素LCA、PSA、AAL、LTL、UEA I购自Vector Laboratories (Burlingame, CA)。凝集素-生物素结合物购自TCI America (Portland, OR)。Oasis MAX 1 cm3萃取柱和Sep-Pak C18柱购自Waters (Milford, MA)。其他资料列于补充材料。

细胞系和培养条件，蛋白质提取，胰蛋白酶消化。本节见补充材料。

完整的Fuc糖肽类富含凝集素和MAX。除AOL凝集素外，所有凝集素均以琼脂糖结合形式购买。根据厂商的AOL-生物素偶联剂和链霉亲和素琼脂糖的说明书，琼脂糖结合剂AOL由凝集素AOL-生物素偶联剂制备。使用前，每个琼脂糖结合的凝集素用TBS缓冲液(pH 7.4)洗涤，去除添加的稳定凝集素的糖。凝集素特异性比较和大规模分析的富集方法详见补充材料。

TMT标签。富集干燥后的样品在50mu;L 200mM的HEPES (pH 8.5)中重组并涡旋混匀。每个TMT 10plex试剂溶解于41mu;L的ACN中，在每根相应的质量标记样管中加入20mu;L。混合均匀，室温孵育1 h。TMT 127和128C通道用于标记两个重复LAPC4样品，以确定分析重现性。TMT通道126、129C和130C分别用于标记LNCaP、PC3和DU145(见图1b)。TMT标记后，5个通道的标记肽段混合后用C18柱纯化。干燥后将组合样品重悬于2% ACN/0.1% FA溶液中，13000 rpm离心10 min后进行nanoLC-MS/MS分析。

NanoLC-MS/MS分析。样品的分离使用Dionex Ultimate 3000 RSLC纳米体系(Thermo Scientific)， PepMap RSLC C18色谱柱(75mu;m 50 cm, 2mu;m, Thermo Scientific)，由一个Acclaim PepMap C18色谱柱(100mu;m 2 cm, 5mu;m, Thermo Scientific)保护。质谱分析使用Thermo Q Exactive质谱仪(Thermo Scientific)进行。LC条件和MS参数在补充材料中有描述。

数据分析。对于完整的糖肽类鉴定，使用公司研发的糖肽类分析软件GPQuest 2.0搜索数据[58]。GPQuest 软件通过选择含水合氢离子的光谱，从原始的LC MS/MS数据中检测糖肽的光谱，并用MS/MS离子将它们与糖肽文库进行匹配。然后通过附加的MS/MS离子和前体离子质量来确定糖基化位点上的糖基修饰。该软件可以从我们的网站(biomarkercenter.org)下载。检索的数据库为人前列腺癌糖基化合物数据库和人N-糖基化合物数据库，分别包含6640和277个条目。MS1和MS2的质量耐受性参数分别为10和20 ppm。选择含水合氢离子m/z 204.08的光谱进行进一步搜索。根据以下标准筛选结果: (1)错误发现率(FDR)小于1%；(2)包含3个或3个以上的肽b/y离子；(3)所有b/y离子的总强度相对于光谱总强度均大于10.0%；(4)剔除所有符合标准的肽谱匹配项（PSMs）。输出TMT报告离子强度用于糖肽类的定量分析。采用SIMCA-P 14.1软件(Umetrics AB, Umea，瑞典)进行多变量统计、正交偏最小二乘-判别分析(OPLS-DA)。

  1. 结果与讨论

Fuc糖肽类富集方式的评价。虽然凝集素对某些糖缀合物表现出选择性特异性，但当凝集素亲和力单独用于从复杂样品中富集糖肽类时，可能发生非特异性结合[59]。Oasis MAX是一种市售的亲水性强阴离子交换柱，已被证明具有高效富集糖肽的能力[60]。为了评估和确定Fuc糖肽类的最佳富集方式，我们分别检测了6种凝集素(LCA、PSA、AAL、LTL、UEA I和AOL)和MAX萃取柱以及它们的联合使用。图S1显示了Fuc糖肽类富集方法的流程，其中6种分别通过不同的凝集素富集，6种分别通过凝集素-MAX(通过凝集素-MAX串联富集)，1种MAX，6种MAX-凝集素(通过MAX-凝集素串联富集)。每种方法中的完整糖肽均通过nan

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