使用环保胶束的HPLC-UV快速同时定量测定缬沙坦和苯磺酸氨氯地平的含量：应用于加标的人体血浆和氨氯地平含量的均匀度测试外文翻译资料

 2022-12-31 12:12

使用环保胶束的HPLC-UV快速同时定量测定缬沙坦和苯磺酸氨氯地平的含量：应用于加标的人体血浆和氨氯地平含量的均匀度测试

原文作者：Fawzia A.Ibrahim,aAmina M.El-Brashy，aMohamed I.El-Awady*ab和Nora A.Abdallaha

单位：曼苏拉大学药学院药物分析化学系

摘要：在不到4分钟的时间内，同时进行了两种常用的共同降压药物缬沙坦（VAL）和苯磺酸氨氯地平（AML）的简单灵敏和经济高效的定量分析。所使用的方法是在整体固定相和室温下进行的，使用的环保胶束流动相包括0.16 M十二烷基硫酸钠（SDS），0.3％三乙胺（TEA）和15％正丙醇的水溶液，用正磷酸调节pH至2.5，并以2 mL/min的流速泵送。使用氯吡格雷（CLP）作为内标（IS），检测波长为240 nm。线性范围为5.0-300.0 mmu;g/mL和5.0-200.0 mu;g/mL，检测限（LOD）为0.15和0.14 mu;g/mL，定量限（LOQ）为0.50以及VAL和AML为0.47 mu;g/mL。将该方法应用于实验室合成混合物和共配制片剂中VAL和AML的同时分析，结果令人满意。由于存在胶束流动相，该方法的灵敏度允许在加标的人血浆中测定AML，而无需进行繁琐的提取步骤。该方法更进一步适用于苯磺酸氨氯地平的含量均匀度的官方指导原则。与官方的方法相比，对获得的数据进行统计评估证明了所设计方法的准确性和精确性。

关键词：荧光光谱测定；荧光检测

介绍

缬沙坦（VAL）（图 1a）化学上是（2S）-3-甲基-2- [戊酰基-[[4- [2-（2H-四唑-5-基）苯基]苯基]甲基]氨基]丁酸1这是一种血管紧张素II受体拮抗剂，用于心力衰竭和高血压治疗，以降低患有心肌梗塞的心室功能不全患者的心血管风险。2

苯磺酸氨氯地平（AML）（图 1b）化学上是3-O-乙基5-O-甲基2-（2-氨基乙氧基甲基）-4-（2-氯苯基）-6-甲基1,4-二氢吡啶-3,5二羧酸1这是在高血压和心绞痛的治疗中常用的钙通道阻滞剂。

AML-VAL通常是联合使用比其他AML-b-受体阻滞剂组合能更有效地降低中心收缩压。

几种同时分析VAL和AML的方法包括HPLC，4–9TLC，10UV分光光度法，11,12分光光度法，13,14伏安法15和毛细管电泳。所使用的方法与之前报道的高效液相色谱法的比较表包括在了ESI（表S1）

据我们所知，所提出的方法是第一个环保胶束HPLC技术，能够同时测定纯净、混合物和片剂中的VAL和AML。

图 1缬沙坦和苯磺酸氨氯地平的化学结构。

胶束液相色谱有简单，易于操作，节省时间和金钱的优点，并且对环境和实验人员均无害。

它还无需事先提取的步骤，能直接注入血浆样品。与以前的HPLC方法消耗大量的有害的有机溶剂（如乙腈或甲醇）17不同，我们所用的方法仅消耗15％的正丙醇溶液。这些溶剂有关的危害不仅影响人类健康，还影响环境生态系统。减少这些有害溶剂的使用是环境保护和经济改善的基本目标。18,19胶束液相色谱法是一个有趣的发展，绿色分析化学（GAC）的目的是通过仅使用少量有机改性剂（最多达到15％，v / v）来免除或减少有机溶剂的使用。这些胶束流动相的特征是非易燃，毒性低，它们减少由于生物降解性使用的表面活性剂。并且由于所用表面活性剂的可生物降解特性，它们可以减少有害废物。20文献包括不同药物应用这种绿色方法以少量使用不同有机改性剂进行的几项研究。21,22

当前的研究旨在建立一种快速、经济和环保的方法来同时分析VAL和AML的混合物。对影响分离过程的不同变量进行了检查和优化，在合理的短时间内获得最佳的分离度和灵敏度，且不会影响分析的性能。在进行完整的验证研究的情况下成功应用于药物剂型。

材料和方法

2.1仪器

使用Merck Hitachi LaChrom HPLC系统型号L-7100和带有20 mL定量环的Rheodyne进样阀进行色谱分析。使用L-7400 UV检测器在240 nm处进行检测，并使用D-7500积分仪记录色谱图。使用Millipore滤膜（SIBATA）过滤流动相，并使用Merck溶剂L-7612脱气机对流动相进行脱气。对于pH测量，使用了Consort P-901 pH计。

2.2材料与试剂

bull; 使用HPLC级溶剂以及分析试剂级化学品。

bull; 瓦萨坦bull;希克马制药（埃及开罗），100.23％;氨氯地平，Hikma Pharma（埃及开罗），99.79％;孟菲斯制药公司（埃及开罗）的氯吡格雷，占99.66％。

bull; 三乙胺（TEA），十二烷基硫酸钠（SDS）和正磷酸85％来自德国Seelze的Riedel-deHacirc;en。

bull; HPLC级甲醇，乙腈和正丙醇购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich。

bull; 标记为包含10毫克AML和160毫克VAL的AlkapressPlusreg;10/160毫克和标记为每片5毫克AML的Alkapressreg; 5毫克片剂是在Hikma Pharma的许可下生产的，并从埃及当地一家药房购买。

bull; 人体血浆样品获自埃及曼苏拉的曼苏拉大学医院，并冷冻保存在-20℃直到在室温下轻微融化为止。在2016年11月6日获得曼苏拉大学药学院伦理委员会的批准后，进行了人体血浆加标分析。

2.3色谱条件

色谱柱：玛瑙单片C18内径 100 mm x 4.6 mm，2 mu;m，高度多孔，Phenomenex公司（美国加利福尼亚州托伦斯市），室温下操作。

流动相：0.16 M十二烷基硫酸钠（SDS），0.3％三乙胺（TEA），15％正丙醇的水溶液，使用正磷酸调节至pH 2.5，并以2 mL / min的流量泵送。使用氯吡格雷（CLP）作为内标（IS），检测波长为240 nm。

标准溶液：在100ml容量瓶中分别溶解40mg的VAL、AML和CLP（IS）（400mg/mL）于100ml甲醇中制备储备溶液。采用流动相稀释法制备工作标准溶液。校准时，使用浓度为40 mu;g/mL的CLP作为内标。

根据峰面积的稳定性和保留时间，所有溶液在冰箱中保存不少于三周。

2.4步骤

构造校正图。将适量的储备溶液的等分转移到两组10 mL容量瓶中，使VAL的最终浓度在5.0–300.0 mu;g/mL和AML的最终浓度在5.0–200.0 mu;g/mL的范围内。然后向每个烧瓶中加入1.0 mL CLP标准溶液（IS），使其最终浓度为40 mu;g/mL，并用流动相将溶液稀释至刻度，并充分混合。然后，通过在最佳条件下进样20 mL体积（三次）进行色谱分离。然后通过绘制平均峰面积比（药物/ IS）对每种药物在mu;g/mL中的浓度的关系图来绘制校准图，然后得出相应的回归方程。

混合物中VAL和AML的分析。对于混合物的分析，通过将VALL和AML原液的混合物混合在10ml的容量瓶中，然后用流动相稀释至VAL和AML 16∶1的药物比例，用来制备混合物的溶液。然后按照“构造校正图”标题的说明处理溶液，然后计算回收率。

分析Alkapress Plusreg;片剂中的药物。称取wenty Alkapress Plusreg;片剂，每个片剂标记含有160毫克VAL和10毫克AML，然后研磨成细粉末。将分别含有16.0和1.0 mg VAL和AML的0.0302 mg细粉转移至100 mL容量瓶中，与约80 mL甲醇混合，超声30分钟，然后用甲醇完成标记，并通过41号Whatmann滤纸过滤。最终得到的浓度为160 mu;g/mL的VAL和10 mu;g/mL的AML。在工作浓度范围内，含有两种药物适当浓度的滤液的小份按照前面在“校准图的构建”中提到的方法进行分析。

该方法在含量均匀性检测中的应用。按照先前描述的分析片剂中两种药物的程序，分别使用10种不同的片剂测定Alkapressreg;中的AML。采用USP23官方指南设计的方法测试其含量的均匀性。

加标人体血浆中AML的分析。将准确体积的AML工作标准溶液转移到一组10 mL容量瓶中，使最终浓度达到5.0–40.0 mu;g / mL的范围。 将CLP以I.S.的形式添加到所有烧瓶中，以使其最终浓度为20.0 mu;g/mL，然后将8 mL的流动相添加到每个烧瓶中，以避免血浆蛋白被甲醇沉淀（AML和CLP溶剂）。 将1 mL人血浆添加到所有烧瓶中，并用流动相将体积补足至刻度，并充分混合，然后如“校准图的构造”小标题中所述进行分析。 同时进行空白实验（在流动相中使用1 mL人血浆）以鉴定最佳条件下的血浆峰。

结果和讨论

采用胶束高效液相色谱-紫外分光光度法同时对VAL和AML的混合物进行了分离。在该方法的最佳色谱条件下，得到了较好的分离标准。在相当短的时间内（不到4分钟）获得了分辨率（Rs）为1/4 3.8和选择性因子（a）为1/4 6.2。图2示出VAL和AML合成混合物的典型色谱图。VAL、CLP和AML的保留时间分别为1.3、2.1和3.4min。

与已报道的HPLC方法相比，4–9所设计的方法具有许多优点，因为它使用的毒性有机改性剂数量较少，符合绿色分析的要求，灵敏度更高，洗脱时间更短。 该方法灵敏度高，可用于他们的共同配制的片剂中VAL和AML的准确调查，人血浆中AML的测定及其含量均匀性检测。

图2（a）在最佳色谱条件下，使用40.0mu;g/mLCLP（IS）的80.0 mu;g/mLVAL和5.0 mu;g/mLAML合成混合物的典型色谱图。（b）使用20.0 mu;g/mLVAL和20.0mu;g/mLAML的合成混合物的典型色谱图。在最佳色谱条件下为40.0 mu;g/mLCLP（IS）。

3.1色谱性能和系统适用性的优化

列的选择。对不同的色谱柱进行分离测试，包括：Hypersiltrade;BDS氰基LC色谱柱（250 x 4.6 mm，5 mm）、Hypersiltrade;苯基LC色谱柱（250 x 4.6 mm，5 mm）、Onyx整体C8（100 mm x 4.6 mm，2 mm）高孔柱和Onyx整体C18（100 mm x 4.6 mm，2 mm）高孔柱。实验研究表明，氰基和苯基色谱柱产生未分辨峰和分裂峰，而整体C8色谱柱产生宽峰，因此最后一个色谱柱是最合适的，因为它会产生具有高分辨率的对称尖锐峰。

选择合适的波长。 为了选择理想的检测波长，使用紫外分光光度计扫描了溶解在流动相中的研究药物标准溶液的吸收光谱（图3）。 发现吸收VAL和AML的最大波长分别为248和239nm。在此基础上，发现两种药物的色谱测定最合适的波长为240nm，显示出最高的灵敏度。

图2（1）氨氯地平和（2）缬沙坦溶解在流动相中的20mu;g/ mL的紫外分光光度法

流动相组成。由于VAL和AML的分配系数（log P）分别为1/3.6和5.9（logp/3.00和pKa/8.6），药物的疏水性明显不同，因此胶束介质非常适合分离。此外，为了提高胶束流动相的分离效率和分离峰的形状，还需要加入TEA和短链醇，通过改变流动相组成，在合理的时间内获得最高的分离度和分辨率。这包括改变有机改性剂的类型和浓度、SDS的浓度和pH值。所得结果见表1。

表1通过设计方法分离VAL和AML的色谱条件的优化

通过实验研究，尝试了10%甲醇、7-9%正丁醇和10%正丙醇等多种有机改性剂，以选择最方便的方法对所研究的药物进行最佳分离。正丙醇是胶束体系中最常用的有机改性剂，在较短的时间内（小于4min）可获得高灵敏度和高分辨峰。

采用含9～16%v/v正丙醇的流动相，研究了不同浓度正丙醇对药物分离的影响。以15%v/v正丙醇为色谱柱，获得了最佳的色谱性能。研究表明，正丙醇浓度的降低导致tr的升高，而正丙醇浓度的升高则导致两种药物峰的tr的降低。

在pH值方面，以pH 2.5为最佳，峰的分辨率高，灵敏度高。pH值研究表明，pH值升高导致两种药物tr降低，pH值降低导致两种药物tr升高。pH值对两种药物分离的影响如表1所示。

在0.8ml/min～2mL/min范围内，研究了不同流速对VAL和AML色谱分离的影响，发现在较短的时间内（4min）以2mL/min的流速分离效果最好。

内标的选择。 如果进样误差是主要误差源（或在生物样品和其他基质干扰的情况下），则使用内标非常重要。 它应稳定，其峰不应与分析物的峰重叠，并且应在合理的时间内以足够的灵敏度洗脱。 测试了不同的药物，包

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