基于透明质酸的肿瘤靶向和pH响应性壳交联纳米颗粒用于阿霉素的控制释放外文翻译资料

 2022-05-01 21:44:21

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基于透明质酸的肿瘤靶向和pH响应性壳交联纳米颗粒用于阿霉素的控制释放

摘要：

在此研究中，通过“点击”反应设计并合成了一系列两亲聚合物前药（叠氮基官能化透明质酸三唑-亚胺-阿霉素，HA-亚胺-DOX），其具有显着的阿霉素接枝率。具有核-壳结构的纳米粒子可以通过在水性介质中自组装而获得，所述水性介质显示出137-170nm的粒径。此外，HA-imine-DOX纳米粒在体外表现出良好的稳定性，且药物释放明显受pH梯度介导。随后，CCK-8测定表明，该纳米系统在正常细胞（小鼠成纤维细胞系，L929）中表现出较低的细胞毒性，并且在肿瘤细胞（人宫颈癌细胞，HeLa）的内/溶酶体pH环境下具有良好的药物释放响应性。HeLa细胞的细胞摄取和流式细胞计数图表明，由于受体介导的CD44对HA具有高亲和性，因此表现出高效的内部化。我们有理由相信这种pH依赖性聚合物前药在癌症治疗中具有潜在应用。

关键词：透明质酸、“点击”反应、pH响应纳米粒子、CD44、药物控释

介绍

癌症仍然是全球第二大死亡原因，并严重威胁人类健康。据报道，四分之一的死亡是由这种主要的全球健康问题导致的，仅超过心血管疾病。幸运的是，由于多种纳米体系如聚合物纳米粒子胶束，树枝状大分子，脂质体，脂质体等的出现，在过去几十年中开发靶向药物递送系统已经取得了相当大的进展。这些药物的一个显着优势是纳米级大小，它有助于抗肿瘤药物或基因的内在化，由于增强的渗透性和保留（EPR）效应并可能诱导的内皮渗漏，以此来达到在靶向部位有效治疗的效果。

刺激响应机制如氧化还原，pH值，温度，离子强度和酶被采用并进一步用聚合物纳米粒子修饰。在这些刺激反应机制中，由于具有特异性触发药物从纳米载体释放的能力，pH敏感性已受到相当大的关注。特别是，含有亚胺键的pH敏感性媒介物由于在以下具有明显的pH梯度结构中的响应性不同：正常组织（pH7.4），肿瘤（pHlt;6.5），内体（pH5.0-6.0）和溶酶体（pH4.0-5.0）中的微酸性细胞外环境）。

尽管只有许多有效的纳米载体,只有少数获得美国食品和药物管理局（FDA）批准，这是因为，在大多数系统中，这些制剂中只有少数药物到达肿瘤组织。所采用的纳米系统应该能够减少释放的早产与药物的相互作用和毒副作用，实现精确的药物组织分布特征，增强细胞内药物释放，控制药代动力学，改善循环过程中的治疗指数。

因此，纳米系统应具有以下特性：（1）生物利用度好，生物相容性好，易降解；（2）通过将化学部分与过表达或独特的癌细胞标记物（单克隆抗体，叶酸受体，DNA）结合，通过EPR被动靶向或活性靶向，适当的粒径，延长的药物半衰期并有效地结合至肿瘤组织适体和CD44受体）具有高特异性亲和力。

透明质酸（HA）是由N-乙酰基-D-葡糖胺和D-葡萄糖醛酸的重复单元组成的天然多糖，它们是细胞外基质的一部分。这些重复单元通常表现出低毒性、非免疫原性、从生物学特性的角度来看具有良好的生物相容性和可生物降解性。与其他多糖纳米载体如羧甲基纤维素、羧甲基壳聚糖、硫酸软骨素、胶原蛋白和海藻酸盐相比，HA显示出有活性的肿瘤靶向能力。此外，由于具有优异的水溶性，因此延长了持续释放的循环时间，它可用于各种生物医学应用。随着单克隆抗体、RNA和DNA适体在体循环中的不稳定性，许多研究已经报道了通过用抗肿瘤药物或纳米颗粒进行装饰将HA用作肿瘤靶向部分。然而，很少有研究使用HA作为肿瘤靶向部分和递送载体。阿霉素常用于各种癌症，如急性白血病、骨和软组织肉瘤、霍奇金病、非霍奇金病淋巴瘤和肺癌、甲状腺癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌和膀胱癌。然而，由于溶解度差和DOX对正常组织的毒副作用，DOX在治疗中的应用受到极大限制。

在这里，我们从HA-亚胺-DOX偶联物的自组装体开发了pH响应性的，壳交联的纳米药物递送系统（方案1），导致显着增加的溶解度，延长DOX的半衰期，增强的细胞内化和细胞-由CD44受体介导的癌细胞的杀伤效率。此外，高效“点击”反应用于稳定的化学结构和高载药量（DLC）以保持血液浓度。由于亚胺键的pH敏感行为的协同作用以及HA与CD44的亲和力的结合，我们预计该纳米系统不仅在目标位点处显示出增强的细胞内化，而且在pH触发的细胞中表现出高性能的杀伤力。

材料和方法

物料

OligoHyaluronan（化妆品级，分子量[MW]5.3,9.8,47.8和93.7kDa）购自BloomageFredaBiopharmaCo.，Ltd。（中国山东）。盐酸阿霉素（DOXHCl，97％）购自深圳市四美全生物技术有限公司（中国深圳）。抗坏血酸钠（NaAsc，98％），购买了五水合硫酸铜（II）（CuSO5HO，99％），叠氮化钠（NaN，99％），N，N-二甲基甲酰胺（DMF），甲酰胺和三乙胺来自国药集团化学试剂有限公司（中国）。1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDCHCl，99％），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，98％）购自EnergyChemicalReagentInc.（Shanghai，China）。HeLa和L929细胞购自中国典型培养物保藏中心（武汉大学）。从HyClone，ThermoFisherScientific获得RoswellParkMemorialInstitute1640（RPMI-1640），青霉素-链霉素混合物（分别为100UI/mL）和胰蛋白酶。胎牛血清（FBS），细胞计数试剂盒-8（CCK-8），4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和甲醛来自Beyotime生物技术研究所（中国上海）。所有其他试剂在没有进一步纯化的情况下直接使用。

叠氮基官能化的透明质酸（HA-N3）的合成

将HA（500mg，1.32mmol）分散在甲酰胺（100mL）中形成5mg/mL聚合物溶液，接着以2摩尔比加入EDCHCl（506mg，2.64mmol）哈；搅拌悬浮液1小时，然后加入NHS（304mg，2.64mmol）并再搅拌2小时以活化羧基。随后，加入2-氯乙胺盐酸盐（1.53g，13.20mmol）；在30C下反应36小时后，将溶液混合物对DMF透析24小时并且去离子（DI）水48小时。最后，将混合物冻干，然后加入DI水（30mL）；然后，NaN（500mg，7.70mmol）加入并在75℃C下在黑暗中搅拌该混合物24小时。使用透析膜过滤器（MWCO：3500）将溶液混合物在去离子水中透析72小时并冻干以获得HA-N缀合物。

小分子前药（亚胺-DOX）的合成

将DOXHCl（200mg，0.346mmol）加入到一个50毫升Schlenk烧瓶中，并将烧瓶在N下用橡胶隔膜密封。TEA（288mu;L，2.076毫摩尔）的甲醇（20毫升）tralize盐酸。将反应混合物搅拌1小时以获得均匀溶液，然后使用注射器加入另一种4-乙炔基苯甲醛（54.04mg，0.415mmol）的甲醇（20mL）溶液。在30C下反应24小时后，将混合物溶液蒸发至2mL；然后加入2mL乙腈，通过在5℃下以10000rpm离心5分钟使产物沉淀三次并且在真空下干燥24小时。最后，获得纯亚胺-DOX，为红棕色粉末，分离产率为83％。对于CHNO[MH]，MS（ESI）计算为655.21；然而，观测值是656.1921（图2（B））。

方案 1：负载DOX的纳米颗粒的形成，肿瘤累积效应，由CD44介导的细胞内化和DOX的pH响应释放的示意图

铜催化炔烃叠氮咔咯环加成反应合成HA-Imine-DOX前体药物及空白结合物

在10mLSchlenk烧瓶中将HA-N（50mg，0.019mmol-N组）缀合物分散在去离子水（2.5mL）中；将CuSO45H0（0.495mg，0.0025mmol）和NaAsc（0.622mg，0.0025mmol）顺序加入到反应混合物中，接着加入TEA获得了适当的pH（8-9）调整。将预定量的亚胺-DOX加入到混合物中；将烧瓶用橡胶隔膜密封，随后通过三次冷冻泵-解冻循环进行脱气。在30C下搅拌24小时后，将粗产物对DMF透析24小时和对水透析48小时并冻干以获得HA-亚胺-DOX前药。然而，通过添加4-乙炔基苯甲醛（2.47mg，0.019mmol）代替亚胺-DOX来合成空白聚合物缀合物（HA-CHO）。

HA，亚胺-DOX，HA-N，HA-亚胺-DOX偶联物和载有DOX的纳米颗粒

用Varian500光谱仪（Varian，USA）获得H-NMR光谱。记录FT-IR光谱以鉴定特征官能团。通过使用FT-IR光谱仪（BrukerTesor27，德国）合成的缀合物。使用紫外分光光度法（UV1101，Techcomp，中国）在DI水中获得UV-Vis吸收数据。通过动态光散射（DLS）测量粒径，PDI和表面zeta;电位。详细地说，所有样品都是在室温和90°散射角下测量的MalvernNano-ZS90zetasizer。所得样品的透射电子显微镜图像通过使用JEM2100F在200keV的加速电压下观察获得。通过使用场发射扫描电子（SEM）显微镜（ZeissUltraPlus，德国）还表征了载有DOX的纳米颗粒的尺寸和形态。所有样品在室温下干燥而不被进一步染色。

HA-Imine-DOX共轭物的DLC和接枝率

将一定量的HA-亚胺-DOX缀合物分散在去离子水中，然后加入特定体积的HCl溶液（1M）并在50°F℃）下搅拌24小时。通过紫外分光光度法（UV1101，Techcomp，China）在482nm的波长测量混合物的吸光度。根据以下等式计算HA-亚胺-DOX缀合物的DLC：

其中CDOX是混合溶液中DOX的浓度（mg/mL）；Vsolution是混合溶液的体积。（mL）；m前体药物是HA-亚胺-DOX缀合物（mg）的重量。根据以下等式计算DOX的接枝率：

其中DS代表HA-N上的-N基团的取代度，nDOX表示1gHA-亚胺-DOX缀合物（mol）中DOX的摩尔数。

制备空白和载有DOX的纳米粒子

将5毫克HA-亚胺-DOX和HA-CHO缀合物分别分散在5mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）中。然后，搅拌0.5小时后获得1mg/mL的均匀纳米颗粒溶液，并使用超声波探头（JY92-2D，宁波科恩茨生物技术公司有脉冲功能（脉冲开启，2.0秒；脉冲关闭，2.0秒），然后在超声波清洗器中在室温下以100W超声处理0.5小时。最后，将溶液通过过滤器（0.45mu;m，孔）过滤曲线（图4（E）），并使用以下等式：

其中Ci和Cn分别表示在时间i和n时DOX的质量浓度（mu;，g/mL）。

体外细胞毒性试验

采用CCK-8分析来评估HA，空白纳米颗粒和HA-亚胺-DOXNP对HeLa和L929细胞的细胞毒性。具体而言，将HeLa或L929细胞接种在96孔板（每孔110细胞）中并维持在100mu;L含有100单位/mL青霉素的10％胎牛血清（FBS）的RPMI1640中，和在5％CO的37C的气氛下，加入100mu;g/mL链霉素。温育24小时后，培养基是取出并用100mu;L新鲜细胞培养物的替换介质，其含有0-100mu;g/mLHA或空白纳米颗粒以评估递送载体的生物相容性。同时，使用0-10mu;g/mL的游离DOX和HA-亚胺-DOXNPs（相当剂量的DOX）来确定细胞毒性。反应24小时，48小时和72小时后，取出培养基并用PBS（pH7.4）洗涤三次；然后，补充100mu;L新鲜细胞培养基。最后，加入10mu;LCCK-8并再温育4小时。用酶标仪在450nm处测量每个孔的光密度（OD）。细胞活力（％）通过以下等式计算：

其中，ODsample为试验组的OD值，ODcontrol为对照组，ODblank为空白组（仅含细胞培养基）。实验重复六次。

激光扫描共聚焦显微镜的细胞摄取

对于游离-DOX和HA-亚胺-DOX的细胞摄取分析，用HeLa细胞将HeLa细胞以RPMI1640完全培养基中的每皿2.5times;105细胞的初始密度接种到35mm培养皿中，并在5％CO在37C24小时。取出培养基并补充2mL新鲜细胞混合物，在相当剂量的DOX（2mu;，g/mL）下含有游离-DOX或HA-亚胺-DOXNP的完全培养基；以预定的时间间隔，丢弃培养基并用PBS洗涤三次。细胞用4％甲醛固定20分钟，并用PBS洗涤三次；随后，细胞核用DAPI染色并用PBS洗涤三次。使用激光扫描共聚焦显微镜获得荧光强度图像。

对于HA对CD44分析的活性结合，将培养基替换为2mL含有5mg/mL游离HA的新鲜无FBS细胞培养基并反应1小时；随后，按照上述程序用含有HA-亚胺-DOXNP的相同细胞培养基代替培养基。

流式细胞术

在RPMI1640完全培养基中将HeLa细胞接种到12孔板（每孔210个细胞）中，并在37℃下在5％CO的气氛下温育24小时。取出培养基并补充2mL含有的新鲜细胞完全培养基以相当剂量的DOX（2mu;g/mL）释放游离DOX或HA-亚胺-DOXNPs；反应1小时和4小时后，丢弃培养基并用3次洗涤PBS。随后，每孔加入1mL胰蛋白酶。在37C处理3分钟后，收集细胞并以1000rpm离心5分钟，悬浮于500mu;LPBS中并使用FACSCalibur流式细胞仪（Becton，DickinsonandCompany，USA）分析。为了重申HA过表达CD44的活性结合，将培养基替换为2mL含有5mg/mL游离HA的新鲜无FBS细胞培养基，并反应1小时；然后，将培养基替换为2mL含有HA-亚胺-DOXNPs的新鲜细胞培养基以及等效剂量的DOX（2mu;，g/mL），并按照上述步骤再温育4小时。

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