瑞德西韦阻滞SARS-CoV-2聚合酶的作用机理外文翻译资料

 2023-03-13 10:03

瑞德西韦阻滞SARS-CoV-2聚合酶的作用机理

原文作者 Kokic, G., Hillen, H.S., Tegunov, D. et al.

单位 Nature Communications

摘要： 瑞德西韦是唯一获得FDA批准，可用于治疗COVID-19的药物。其活化形式可作为核苷类似物，抑制包括SARS-CoV-2在内的冠状病毒的RNA聚合酶(RdRp)。RdRp把瑞德西韦结合到复制过程RNA产物中，使RNA在合成停滞之前再添加三个核苷酸。在研究使用合成RNA化学、生物化学和冷冻电子显微镜来创立瑞德西韦诱导RdRp阻滞的分子机制。研究表明，瑞德西韦与RNA产物结合后，冠状病毒RNA添加第四个核苷酸时会因RNA易位势垒受阻。易位势垒导致RNA 3ʹ-核苷酸在RdRp的底物结合位点中保留，同时干扰下一个三磷酸核苷进入复制过程，从而阻滞RdRp。在瑞德西韦停滞状态的结构中，RNA复制产物的3ʹ-核苷酸与活性中心的模板碱基对配位，这可能会阻碍病毒3ʹ-外切酶的校对。这些机制有助于研究者寻求基于冠状病毒复制的改良抗病毒药物。

关键词：RdRp阻滞； 易位势垒； 瑞德西韦；新型冠状病毒

1.研究介绍

冠状病毒利用RdRp进行RNA的复制和转录。其RdRp由三个非结构蛋白(nsp)亚基组成：催化亚基nsp126和辅助亚基nsp8和辅助亚基nsp73。SARS-CoV-2的RdRp通过游离核苷和RNA模板双链合成。本研究结合SARS-CoV RdRp的前体结构，阐明了RdRp的作用机制。对于依靠RNA聚合酶的RNA复制而言，–1位点结合RNA产物链的3ʹ端核苷酸， 1位点结合插入的三磷酸核苷(NTP)底物。催化核苷酸结合的RNA易位并释放 1位点以结合下一个进入的三磷酸核苷(NTP)。

核苷类似物瑞德西韦是唯一获得FDA批准，可用于治疗COVID-19的药物。瑞德西韦抑制冠状病毒的RdRp，在细胞培养和动物研究中均显示出抗病毒活性。瑞德西韦是一种氨基磷酸酯前体药物，在细胞中代谢产生活性NTP类似物三磷酸瑞德西韦(RTP)。生化研究表明，RdRp可以使用RTP作为底物，使瑞德西韦单磷酸(RMP)结合到复制中的RNA产物。在RMP结合后，RdRp在RNA延伸三个核苷酸后停滞。这种停滞机制是冠状病毒所特有的，其他病毒如埃博拉病毒，其RdRp在RMP结合后可再延伸五个RNA核苷酸后方才停滞。

最近相关结构研究表明，RdRp-RNA复合物在瑞德西韦活化形式插入RNA 3ʹ端后，其中一个结构在 1位点中包含 RMP，而另一个结构在–1位点中包含 RMP。在这两种结构中，RMP作为单磷酸腺苷(AMP)类似物，在RNA模板链中与单磷酸尿苷(UMP)形成标准的Watson-Crick碱基对。这些结构研究阐明了RMP是插入RNA中而不是插入AMP中。然而，他们并未解释瑞德西韦是如何抑制RdRp的。因为RdRp阻滞是发生在RNA插入三个核苷酸之后。

2.研究结果

2.1基于瑞德西韦的RdRp阻滞生化重建

为了研究瑞德西韦诱导的RdRp阻滞机制，研究首先使用生化系统(方法)研究了RTP(图1a)如何影响RNA模板产物链上的RdRp伸长活性(图1b)，研究结果与最近的相关研究一致。我们观察到RMP易于与RNA结合，且在RNA合成停滞之前会再添加三个核苷酸(图1c，d)。但在高NTP浓度下，即使RNA产物中存在RMP， RdRp停滞受到很大程度上的抑制，最终形成了全长RNA产物(图1c，d)。因此，瑞德西韦与生长RNA结合后的主要作用机制是延迟RdRp停滞。虽然我们不能排除部分RdRp-RNA复合物可能解离并终止RNA伸长，但在最近的单分子研究中均证明了类似的延迟停滞机制。

a.三磷酸瑞德西韦(RTP)的化学结构 b.RNA模板-产物双链以及RNA伸长方向 c.瑞德西韦诱导的RdRp阻滞。用RTP代替ATP会导致在添加三个核苷酸后产生易位势垒，而在较高的NTP浓度下势垒消除。RNA 5ʹ端包含荧光标记，星号表示 3ʹ-dGTP。源数据作为源数据文件提供。d.一式三份测量后对实验进行定量，显示标准偏差

2.2含瑞德西韦的RNA核苷酸的制备

研究旨在确定RNA产物链中含有RMP的RdRp-RNA复合物的结构用以揭示瑞德西韦诱导的RdRp阻滞机制。研究通过1ʹ-氰基-4-氮杂-7，9-二氮杂腺苷(Rem)分四步合成3ʹ-氰乙基二异丙基亚磷酰胺(Rem-PA)，然后利用5ʹ-O-DMT-2ʹ-O-TBDMS保护3ʹ-氰乙基二异丙基亚磷酰胺(Rem-PA)，再通过固相合成制备含RMP的RNA核苷酸(图2a，方法与补充方法)。在消化成单核苷后，通过DHPLC和LC-MS证实了所获得的RNA核苷酸中含有RMP(图2b，c)。同时此研究进一步证实，RMP的存在抑制了RdRp在最小RNA模板产物链上的RNA复制(图2d，e)。

a.5ʹ-O-DMT-2ʹ-O-TBDMS保护3ʹ-氰乙基二异丙基亚磷酰胺(Rem-PA)的合成方案，用于在指定位置合成RNA核苷酸与瑞德西韦单磷酸(RMP)b.通过DHPLC对含RMP的RNA进行分析，证实了RMP的存在 c.在消化成单核苷后，用LC-MS对含RMP的RNA进行分析，证实了RMP的存在d.在合成的RNA核苷酸产物链中具有RMP(R)或AMP(A)的最小RNA模板产物链e.在合成的RNA核苷酸中， RMP的存在抑制RdRp在最小RNA模板产物链上的RNA复制(d).源数据作为源数据文件提供。

2.3基于瑞德西韦的RdRp阻滞结构分析

我们从指定位置含有RMP的RNA的结构上捕获了RdRp-RNA复合物的两种状态。这两种状态与瑞德西韦诱导的RdRp阻滞有关。具体而言，我们研究了RNA结合RMP后再与两个或三个核苷酸结合形成的RdRp-RNA复合物。研究通过热处理含有RMP的短RMP寡角蛋白生成长的环状RNA(分别为支架1和2)来制备在3位或4位处含有RMP的RNA支架。再将热处理后的RNA支架与纯化的RdRp结合并进行冷冻电镜分析，从而产生两种精细结构(补充表1)。

第一个RdRp-RNA结构(结构1)在3.1Aring;分辨率下解析(补充图1)，结果显示RMP位于RNA产物链的3位，和支架1设计预期结果相同(图3a，b)。–1位点结合RNA 3ʹ端， 1位点自由结合下一个NTP底物。我们将其之前的RdRp-RNA复合结构进行比较无显着差异。RMP核糖部分的1ʹ-氰基位于3位并由RdRp的RNA产物结合位点的开放空间容纳(图3a，b)。故，结构1表示延长复合体的活性状态，其表明在RdRp停滞之前，RNA将再添加一个核苷酸，此现象同生化实验结果一致。

a.在RdRp-RNA复合结构1-3中观察到的RNA支架1-3的位置。模板在顶产物链在底。b. RdRp-RNA复合结构1-3活性中心RNA的冷冻电镜密度。对活性位点金属离子建模显示为洋红色球体c. RMP核糖部分(紫色)的Clʹ-氰基团位于3位(左)，但其会与4位(位置右)的nsp12残留丝氨酸-861(红色)的侧链冲突。球体表示原子范德华曲面。

2.4易位屏障是瑞德西韦诱导RdRp阻滞的基础

第二个RdRp-RNA复合物结构(结构2)在3.4Aring;分辨率下解析(补充图1)，结果表明部分RMP不位于4位而是位于3位，这和支架2设计预期结果相同(图3a，b)。结构1研究结果表明，RNA 3ʹ端的核苷酸占据 1位点，使其不再处于游离状态。RdRp-RNA复合物则处于预易位状态，不能和下一个NTP底物结合。结构2表明RNA产物链中的部分RMP在4位处立体冲突。这些结果证实了瑞德西韦诱导RdRp阻滞是由于RNA易位势垒。

为了验证RdRp阻滞是由易位势垒引起这一假设，本研究用AMP取代RMP的结构2 RNA支架构建了第三个RdRp-RNA复合物，其在2.8Aring;分辨率下解析(图3a，b和补充图1)。结果表明在结构3中，RdRp-RNA复合物处于易位后状态， 1位点处于游离态，与结构1所示相同。这表明，RMP的存在造成了结构2的预易位状态，而RNA产物链中的部分RMP在4位处立体冲突。总而言之，RNA产物链中的部分RMP产生易位屏障，阻碍了RMP从3位转移到4位。

3.结果讨论

研究结果确定了瑞德西韦诱导的RdRp阻滞的结构机制。其直接表明，阻滞是由RdRp在瑞德西韦与复制中的RNA结合再添加三个核苷酸后遇到的易位屏障引起的。基于先前研究，我们确定了瑞德西韦核糖分子中的Clʹ-氰基的存在造成了易位屏障。

首先，这个氰基是抗埃博拉病毒效力的关键。其次，在RNA产物链的4位建立RMP模型会导致与nsp12中的丝氨酸-861的侧链发生立体冲突。这一模型余实验结果一致(图3c)。第三，当丝氨酸-861截断为丙氨酸或甘氨酸时，瑞德西韦对RdRp抑制程度降低或不抑制。故本研究结论为：易位屏障是由于RMP中的氰基通过RdRp的nsp12亚单位中的丝氨酸-861侧链时受到了立体障碍。

我们通过分子动画总结了瑞德西韦诱导RdRp阻滞的机制(补充电影1)。结构2中可以观察到瑞德西韦的阻滞态。在此结构中，RNA产物的3ʹ-核苷酸与RNA模板链进行碱基配对(图3a，b)。这一现象解释了部分RNA的 3端可以逃脱病毒外切酶nsp14校对的原因。然而，病毒外切酶可以从碱基配对的RNA 3末端去除几个核苷酸故病毒外切酶的校对并未完全抑制，瑞德西韦的治疗效率也因此降低。

最后，尽管瑞德西韦与生长中的RNA结合后阻滞RdRp可能是一种重要的抑制机制，但最近提出了另一种基于RNA模板依赖性抑制RdRp的瑞德西韦作用机制。未来将对这种替代机制和RdRp依赖的RNA校对机制进一步研究。无论如何，这里提出的机理见解将有助于寻找具有改进潜力的化合物以用于干扰冠状病毒的复制。

4.研究方法

本次实验未使用统计学方法来预先确定样本量。实验非随机且研究者在实验和结果评估过程分配非盲目。

4.1RNA延伸实验

按所述方式制备SARS-CoV-2 RdRp。nsp12的合成基因通过PCR扩增(正向引物: 5′-TAC TTC CAA TCC AAT GCA TCT GCT GAC GCT CAG TCC TTC CTG-3,反向引物: 5′-TTA TCC ACT TCC AAT GTT ATT ATT GCA GCA CGG TGT GAG GGG-3)并克隆到载体pFastBac 438C (Addgene #154759)。蛋白质在Hi5细胞中表达60小时。离心后，用裂解缓冲液(300mM NaCl，50mM Na-HEPES pH7.4，10%(v/v)甘油，30mM咪唑pH8. 0，5 mM beta;-巯基乙醇，0.284 mu;g/ml亮肽素，1.37 mu;g/ml 抑肽素，0.17 mg/ml PMSF，0.33 mg/ml 苯甲脒和3 mM MgCl2)超声裂解。裂解产物纯化后在裂解缓冲液中预平衡HisTrap HP 5ml(GE Healthcare)，蛋白质用镍洗脱缓冲液(300 mM NaCl，50 mM Na-HEPES pH 7.4，10%(v/v)甘油，500 mM咪唑pH 8.0，3 mM MgCl2和5 mM beta;-巯基乙醇)洗脱至含有淀粉树脂的XK柱16/20(GE Healthcare)。然后蛋白质在直链淀粉洗脱缓冲液(300 mM NaCl，50 mM Na-HEPES pH 7.4，10%(v/v)甘油，116.9 mM麦芽糖，30 mM咪唑pH 8.0，5 mM beta;-巯基乙醇)中洗脱。纯蛋白组分用TEV蛋白酶消化一夜。消化后的蛋白质溶液通过HisTrap HP 5 ml柱和HiTrap Heparin 5 ml柱(GE Healthcare)。所得溶液再通过HiLoad S200 16/600 pg柱，在尺寸排阻缓冲液(300 mM NaCl, 20 mM Na-HEPES pH 7.4, 10% (v/v)甘油, 1 mM MgCl2, 1 mM TCEP)中平衡，浓缩并进一步纯化。峰值馏分被汇集、浓缩至102mu;M、等分、闪冻并储存在-80℃直到使用。浓缩。

通过PCR扩增nsp8和nsp7的合成基因(nsp8: (正向引物: 5-TAC TTC CAA TCC AAT GCA GCA ATT GCA AGC GAA TTT AGC AGC CTG-3,反向引物: 5-TTA TCC ACT TCC AAT GTT ATT ACT G C AGT TTA ACT GCG CTA TTT GCA CG-3; nsp7:正向引物: 5-TAC TTC CAA TCC AAT GCA AGC AAA ATG TCC GAT GTT AAA TGC ACC AGC-3, 反向引物: 5′-TTA TCC ACT TCC AAT GTT ATT ACT GCA GGG TTG CAC GAT TAT CCA GC-3)并分别克隆到pET衍生的载体14-B (nsp7:Addgene #154757，nsp8:#154758)。nsp7和nsp8以相同方式进行表达和纯化。将蛋白质在大肠杆菌BL21(DE3)RIL细胞中表达。用0.5mM的异丙基beta;-D-1-硫代半乳糖苷诱导大肠杆菌细胞，在18℃下振荡16小时。表达后，离心并立即在裂解缓冲液(300mM NaCl，50mM Na-HEPES pH 7.4，10%(v/v)甘油，30mM咪唑pH 8.0，5mM beta;-巯基乙醇，0.284mu;g/m

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