下丘脑组胺H1受体-AMPK信号传导时间依赖性介导奥氮平引起的雌性大鼠的食欲过盛和体重增加外文翻译资料

 2022-07-18 20:17:11

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下丘脑组胺H1受体-AMPK信号传导时间依赖性介导奥氮平引起的雌性大鼠的食欲过盛和体重增加

摘要 虽然第二代抗精神病药引起严重的体重增加和肥胖，但缺乏关于抗精神病药导致的肥胖症逐渐发展的详细知识。本研究在奥氮平诱导的体重增加的三个不同阶段（第1-12天：早期加速，第13-28天：中间新平衡，第29-36天：晚期严重体重维持）检查了下丘脑组胺H1受体和AMP-活化的蛋白激酶（H1R-AMPK）的信号传导。在早期的加速阶段，这些大鼠是吞噬性的，因有一种潜在机制，即奥氮平会增加H1R mRNA的表达和AMPK磷酸化（pAMPK），其中pAMPK水平与H1R mRNA表达和食物摄取呈正相关，在中期，当大鼠不再吞噬时，H1R-AMPK信号的变化消失。在后期，奥氮平使H1R mRNA表达增加且与体重增加呈正相关，但pAMPK减少且与体重增加呈负相关。这些数据揭示H1R-AMPK信号表达的时间依赖性变化，其中奥氮平通过阻断H1Rs并在急性期引起食欲过盛而激活AMPK。 H1R的慢性阻滞可能在奥氮平引起的重体重维持的晚期阶段有所作用。但是，pAMPK不再升高，实际上下降了。这表明AMPK充当能量传感器，并对奥氮平引起的正能量平衡起相反作用。此外，我们还发现H1R激动剂2-（3-三氟甲基苯基）组胺可以以剂量依赖的方式显著抑制奥氮平诱导的中底叶下丘脑中的食欲过盛和AMPK活化。因此，降低H1R-AMPK信号传导是治疗由奥氮平引起的、与肥胖相关的食欲过盛的有效方法。

1.引言

抗精神病药引起的肥胖是严重的副作用，需要系统而深入地了解肥胖症进行性发展中涉及的分子机制，以制定适当的治疗策略。 临床证据表明，非典型抗精神病药物引起的肥胖（氯氮平和奥氮平）的发生有三个不同的阶段：早期加速阶段（前3个月）体重迅速增加; 中间新平衡期（3-18个月）体重增加率下降; 最后是体重平稳，继续抗精神病药物治疗（gt; 18个月，晚期）（Allison和Casey，2001; Pai等，2012）。 在老鼠身上已经表明奥氮平诱导的肥胖症具有类似的体重增加模式，尽管每个周期更短（Huang等人，2006）。 这些研究结果表明，在奥氮平诱导肥胖发展的不同阶段，机制可能会有所不同。

在临床中，抗精神病药物对H1受体的亲和力预测（Kroeze等，2003）抗精神病药物会诱导体重增加，Matsui-Sakata等，2005证明二者确实相关。 在大鼠中，奥氮平治疗改变了下丘脑H1受体mRNA的表达，这与体重增加呈负相关（Han et al。，2008）。 因此，H1受体拮抗作用似乎是奥氮平诱导肥胖的关键因素（Deng等，2010; He等，2013）。 事实上，倍他司丁（一种H1受体激动剂/ H3受体拮抗剂）已被用于预防奥氮平引起的人类（Poyurovsky等，2005,2013）和大鼠（Deng等，2012）的体重增加。

下丘脑AMP激活的蛋白激酶（AMPK）调节食物摄取。 据报道，组胺可降低pAMPK，这一作用可被小鼠下丘脑切片中的氯氮平逆转（Kim et al。，2007）。 此外，氯氮平不能提高敲除H1受体的小鼠中的pAMPK（Kim等，2007）。有其他研究者报道，下丘脑AMPK可被奥氮平激活（Martins等，2010; Sejima等，2011; Skrede等，2013）。 这些数据表明或许H1受体激动剂可用于逆转奥氮平引起的pAMPK升高并预防奥氮平引起的肥胖。

由于奥氮平引起肥胖的不同阶段机制可能会有所不同，因此需要提出两个关键问题：是否下丘脑H1受体-AMPK信号在奥氮平诱导的肥胖的不同阶段发挥不同的作用？H1受体-AMPK信号是治疗奥氮平所致肥胖的潜在靶点吗？本研究首次提出证据表明：下丘脑H1受体-AMPK信号的时间依赖性调节机制是奥氮平诱导的肥胖三个发育阶段的基础。我们测试了中枢H1受体激活在降低奥氮平诱发的食欲过盛中的作用及其与下丘脑AMPK信号传导的关系。

2.材料和方法

2.1动物、药物和化学品

雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠（体重200-225g）从动物资源中心（澳大利亚华盛顿州珀斯）获得。 大鼠在22℃，12小时光照 - 黑暗循环（0700h光照）下饲养。在整个研究过程中，食物和水都可自由摄取。 所有的动物程序都由动物伦理委员会批准，澳大利亚卧龙岗大学，并遵守澳大利亚“由于科学目的而看护和使用动物的行为准则”（2004年）。 奥氮平（Zyprexa）购自美国印第安纳州印第安纳波利斯的礼来公司（Eli Lilly）。 2-（3-三氟甲基苯基）组胺（FMPH）和吡拉明得自Sigma-Aldrich（Sigma，NSW，澳大利亚）。

2.2试验一

为了研究下丘脑H1受体-AMPK信号在奥氮平诱导的体重增加的三个阶段中的作用，我们进行了该实验以检测在奥氮平处理8,16和36天时H1受体-AMPK信号的变化。 模拟奥氮平诱导的体重增加的大鼠模型已经在我们的实验室中建立（Zhang等，2014）。 SD大鼠随机分为3组并用奥氮平治疗8,16和36天，以代表奥氮平诱导的体重增加的早期，中期和晚期（Huang等人，2006）。奥氮平（1mg / kg）或安慰剂每天三次（相当于3mg / kg /天）以每8小时的间隔在07:00，15：00和23：00（n = 12 /组）口服给药。给大鼠喂甜饼干面团（62％碳水化合物，22％蛋白质，6％纤维，10％维生素和矿物质）与奥氮平或安慰剂混合（Zhang et al。，2014）。 每2天记录食物摄入量和体重。 奥氮平的剂量根据我们以前的研究来选择（Zhang等人，2014）。 计算出来为临床相关剂量10 mg / d（根据不同物种的体表面积计算）（Reagan-Shaw等，2008），并在临床上模拟了奥氮平诱导的肥胖症。最后一次药物治疗两小时后，使用二氧化碳（CO 2）窒息（09：00-11：00）将大鼠安乐死。 立即收集大脑。 迅速在冰上解剖下丘脑，在液氮中冷冻，然后保存在-80℃。

2.3实验二

为了解决直接激活中枢H1受体是否能减少奥氮平引起的食欲过盛以及这种效应是否与下丘脑AMPK信号传导有关的问题，奥氮平治疗的大鼠被给予H1受体激动剂的脑室内（icv）注射。 驯化后，每只SD大鼠在异氟烷麻醉下（前囟后1.0mm，中线外侧1.5mm，顶部头骨下3.5mm）手术植入24号导管插入侧脑室（Paxinos和Watson ，2007）。恢复一周后，给以口服奥氮平或安慰剂（与实验一相同）4天。 第五天，大鼠接受0,100nmol或200nmol（Lecklin等，1998）以5ml / min的速率注射H1受体激动剂，2-（3-三氟甲基 - 苯基）组胺（FMPH）或盐水（n = 5-8 /组），并且体积为5ml（组1，媒介/生理盐水;组2，载体/ FMPH 200nmol; 第3组，奥氮平/盐水;组4，奥氮平/ FMPH 100nmol; 第5组，奥氮平/FMPH 200nmol）。 30分钟后，大鼠给以口服相同剂量的奥氮平或载体。在奥氮平或载体施用后1,2,4,16（过夜）和24小时测量所有大鼠的食物摄取量。为了测试FMPH 200nmol对奥氮平处理的大鼠的食物摄入的抑制作用是否会被H1受体拮抗作用逆转，在给予FMPH之前，给大鼠ICv注射吡拉敏（800nmol），然后测试食物摄取（第6组，奥氮平/ FMPH200nmol /吡拉明800nmol）。为了进一步检查H1受体-AMPK信号在奥氮平诱导的食欲过盛中的作用，在三天的药物清除期后重复相同的治疗。然后在最后一次处理（12：00-14：00）后1小时使用CO 2窒息处死大鼠以检测下丘脑中的H1受体-AMPK信号传导。根据标准大鼠脑图谱（Paxinos和Watson，2007）鉴定和解剖下丘脑细胞核。简而言之，将大鼠脑速冻，分别在来自Bregma的500mM冠状切片上切割弧形核（Arc），晶状体核（PVN）和下丘脑外侧区（LHA） -2.16 mm to -3.60 mm, -1.44 mm to-2.04 mm, and -2.16 mm to -3.60 mm。温度设定在-18℃。使用微型冲头（57401，Stoelting Co，Wood Dale，IL，USA）（Zhang等，2014）将核解剖。 Arc在第三脑室以重叠的方式解剖。由于弧度小，被打孔的组织主要包含Arc，但不能排除包含相邻的脑区域，因此包含Arc的被打孔的组织被命名为中间基底下丘脑（MBH）。

2.4实时定量PCR

实时定量PCR检测H1受体，AMPKa，乙酰辅酶A羧化酶a（ACCa，AMPK的下游靶标）mRNA的表达，促肾上腺皮质激素释放激素（CRH），瘦素受体和食欲素A的mRNA表达。 解剖的下丘脑被均化，根据制造商的说明使用Purlink TM RNA迷你试剂盒（Life Technologies，NSW，澳大利亚）分离RNA。 使用Superscript 1 VILO TM cDNA合成试剂盒（Life Technologies）将RNA转化为cDNA。 使用LightCycler 480实时PCR仪器（Roche Applied Science，NSW，澳大利亚）和TaqMan 1基因表达测定（Life Technologies）进行RT-PCR，：H1受体（测定号Rn00566691_s1）;AMPKa2（化验编号Rn00576935_m1）; ACCa（化验号Rn00573474_m1）; CRH（化验编号Rn01462137_m1）;瘦素受体（测定号Rn01433205_m1），神经肽Y.（NPY）（Rn00821417_m1），刺豚鼠相关肽（AgRP）（Rn01431703_g1）和食欲肽-A（测定号Rn00565995_m1）。使用beta;-肌动蛋白（测定号Rn00667869_m1）作为内源对照。 扩增进行了40个循环的95℃变性，然后在60℃退火/延伸。 用二维DDCT方法计算结果（Schmittgen和Livak，2008）。

2.5 Western印迹

按照前述方法进行Western印迹（duBois等，2012）。 将组织在NP40细胞裂解缓冲液（Life Technologies）中匀浆，该裂解液中含有蛋白酶抑制剂混合物，beta;-甘油磷酸酯和苯基甲磺酰氟（Sigma，NSW，澳大利亚）。 通过DC蛋白质测定（Bio-Rad Laboratories，Gladesville，Australia）检测蛋白质浓度。将蛋白质加载到4-12％Bis-Tris凝胶（Bio-Rad）上。在200V下电泳50分钟后，将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PDVF）膜（100V，1小时）（Bio-Rad）。 然后将膜在含有0.1％吐温20（TBST）的tris缓冲盐水中的5％牛血清白蛋白（BSA）中封闭1小时，并且在1％1000与1％BSA中的初级抗体在4℃下温育过夜，以达到AMPKa，ACC 和磷酸-AMPKa（pAMPKa）（Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA）和磷酸-ACCA（pACCa）（Millipore，Billerica，MA，USA）。在TBST中洗涤3-5分钟后，将膜与山羊抗兔（1：5000 Santa Cruz Biotechnologies，Santa Cruz，CA，USA）和辣根过氧化物酶缀合的二抗在25℃温育1小时。 使用增强化学发光（ECL）试剂盒（GE Healthcare，Rydalmere，NSW，澳大利亚）检测免疫蛋白。 使用Bio-Rad Quantity One软件对结果进行量化。根据以前的研究（Ferno et al。，2011），定量对b-肌动蛋白进行了标准化。

2.6统计分析

统计数据由SPSS 19.0程序执行（芝加哥，IL，美国）。 在实验一中，以双向方差分析（ANOVA）（奥氮平*时间为重复测量）和独立的不成对学生t检验（双尾）来分析每两天奥氮平与对照组之间的食物摄取和体重增加的统计学差异。使用独立的不配对学生t检验（双尾）分析H1受体，AMPKa和ACCa mRNA表达以及pAMPKa和pACCa蛋白表达的差异。在实验二中，采用Kruskal-Wallis H检验和Mann-Whitney U检验，来比较icv注射后食物摄入量，下丘脑瘦素受体，食欲素A，促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）和NPY与AgRP mRNA表达的差异。

采用单因素方差分析，然后用Tukey多重比较进行分析不同下丘脑区域中pAMPKa和pACCa表达的统计学差异。 相关性用Pearson相关来确定。 所有数据均以平均值plusmn;SEM表示。统计显着性定义为ple;0.05。

3.结果

3.1 在奥氮平诱导的肥胖早期阶段，食欲过盛导致体重迅速增加

在每48小时测量一次的前12天内，奥氮平治疗引起食物摄入量的显着升高（图1A）;双向方差分析（olanzapine？时间重复测量），随后每个时间点进行一次独立的Student#39;s t检验，所有p lt;0.05，n = 12 /组），但不包括第14-36天（所有pgt; 0.05，Student#39;s检验）。在整个治疗期间用奥氮平治疗的大鼠具有较高的体重（所有p lt;0.05，Student#39;s t检验），在此期间，奥氮平在头12天（早期）迅速增加体重，从第13天到第28天（中期）增速变慢，然后从第29天到第36天（晚期）达到高原（图1B）。 Pearson相关分析显示，累积食物摄入与奥氮平诱发肥胖早期的体重增加显着相关，但在中后期没有显

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