基于智能手机的α-唾液淀粉酶的即时检测外文翻译资料

 2022-08-06 09:33:59

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基于智能手机的alpha;-唾液淀粉酶的即时检测

我们在这里做一个基于智能手机的生物电位传感器测试alpha;-唾液淀粉酶（sAA）的报告，其中唾液淀粉酶是自主神经系统活动最敏感的指标，因此也是良好心理健康非侵入性的生物标志物。生物传感系统包括一个安装了sAA检测应用程序的智能手机、电位器和传感芯片预装试剂。唾液通过取样吸蕊进入传感芯片的反应区与sAA的预装试剂发生反应，产生电子介体Fe（CN）63- 转换为Fe（CN）64-。传感芯片是通过手指将反应混合物挤压入检测区域进行电位测量。测量的电位通过USB接口发送到智能手机应用程序，最后根据浓度校准曲线得到唾液淀粉酶的浓度。使用此类检测方法，人类sAA样品定量分析将在5分钟之内分析完，测量的结果具有很好的重复性，并表现出测量者的心理状况。

  1. 简介

alpha;-唾液淀粉酶（sAA）是一种消化酶，可以催化淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖。近年来，因为唾液淀粉酶与自主神经系统（ANS）活动有关，可以作为一个测试心理健康非损伤性的生物标志物，唾液淀粉酶越来越受众专家学者的关注。越来越多的研究显示唾液淀粉酶的浓度水平与压力、情绪、疲劳等有关。然而，唾液淀粉酶是一种易失活、生命周期有限的酶。唾液淀粉酶的生理浓度在一天中的变化是有规律的，想要合理地解析数据，就必须要多次的测量。因此，开发简单、快速和廉价的生物传感器检测唾液淀粉酶对生物生理研究是非常有意义的。

对alpha;-唾液淀粉酶的分析有多种方法。基于原理不同，他们大致可以分为三种类型：（1）使用alpha;-唾液淀粉酶和抗体之间的特异性结合反应，检测结合反应产生的相应信号；（2）通过记录传感器的特定共振频率或者淀粉凝胶的聚合时间，使用淀粉酶催化作用，检测消耗的淀粉量；（3）利用alpha;-唾液淀粉酶催化淀粉水解，分析水解后的产物，如麦芽糖、葡萄糖，或者通过加入其他物质检测显色反应。

然而，这些方法大多是能满足，即时检测的要求，并且不能用于个人心理测量。这些方法通常需要昂贵和不稳定的试剂（如抗体，染料），需要制冷或专用仪器，依赖于训练有素的人员操作。这些方法有些是专门用于分析血液或血清中的alpha;-唾液淀粉酶，并不能很容易地用于唾液淀粉酶的检测。此外这些方法可以利用成熟的生产设备，成为已经商业化的即时检测传感设备（类似于血糖仪）。然而，他们的方法需要大量的唾液样本（20–30mu;L），需要唾液吸收棒插入人的嘴巴来获取样本，这会导致神经刺激影响唾液淀粉酶的异常分泌。有报道称，该方法的检测会产生结果偏差。

过去的十年里，基于手机的即时生物传感器有了快速发展。这里我们将介绍一种基于智能手机的唾液淀粉酶定量检测传感器。整个系统是由一个具有唾液淀粉酶检测应用程序的智能手机、电位器和预载有检测试剂（包括淀粉、铁氰化钾和氢氧化钠）的传感芯片。唾液样本通过毛细作用被吸取到芯片的反应区，唾液淀粉酶水解淀粉产生麦芽糖，导致碱性条件下铁氰化钾转化为亚铁氰化钾。然后用手指按压传感芯片，将反应混合物引入检测区，铁氰化钾与亚铁氰化钾浓度的变化将会产生电极的电位差，使用电压读取装置进行电位测量，采集信号并通过USB发送到智能手机。应用手机客户端的程序对电压信号进行分析，通过校准曲线将所得结果转为唾液淀粉酶的浓度。

这种生物传感器及其检测系统具有十分重要的意义，原因如下：首先，唾液淀粉酶生物传感器是基于简单的基于毛细管取样和量化的电化学检测，通过特殊的芯片设计吸取样品并促使其流动因此该平台只需要一步操作，一步反应，而不是多次连续的反应；其次，电位读写器十分简单，成本较低，操作简便，使用智能手机的电源作为电源进行数据处理，不需要额外的电源或设备；第三，所有的试剂（如淀粉、铁氰化钾和氢氧化钠）在室温下是稳定的，不需要长期冷冻保存，寿命较长；第四，唾液淀粉酶检测只需要2.5mu;L的唾液，大量的唾液采集则会导致人的神经受到刺激，导致结果的偏差；最后，在我们的实验室一个人一天可以生产150个这样的芯片，其成本不到0.2美元大规模的唾液淀粉酶芯片的生产可以利用特定的生产设备（丝网印刷、激光切割等）在血糖传感器的产业链下，可以进一步降低成本，提高生产效率。因此，相比较而言，该唾液淀粉酶传感是目前一个具有代表性的进步。

2 实验

2.1 试剂盒材料

铁氰化钾、氢氧化钠、淀粉酶、淀粉、磷酸缓冲液（pH7.4）均从Sigma-Aldrich购买。alpha;-淀粉酶检测试剂盒从建成生物工程研究所（中国南京）购买。导电油墨从Creative Materials（美国）购得。银导电油墨从Alfa Aesar购买。透明胶片（2190号）是从Minnesota Mining and Manufacturing 公司（美国，明尼苏达）获得的。双面胶带是购自Soken化学工程有限公司（日本，东京）。激光切割机由华泰激光雕刻公司（中国深圳）购买用于设备制作。紫外分光光度计（Cary 60, Agilent Technologies）用于唾液淀粉酶参考数据分析。所有溶液的配制使用二次蒸馏水，使用试剂没有经过二次处理。

2.2 生物传感器

生物传感系统由传感芯片、电位器、和一个安装了检测唾液淀粉酶的程序的Android智能手机组成。电压读取器的手机应用的开发得到了Ruihan电子科技公司的帮助（中国南通）。

如图1a所示，唾液淀粉酶传感芯片（9毫米*16毫米）有三层（图1B）。顶层为一层透明胶片，它被用作基底的工作电极和参比电极的印刷，中间层为双面胶带，采用激光切割机切割成特定形状。底部层是亲水性的，因此，当三层组装成传感芯片，就形成了毛细作用通道。

图1（a） 唾液淀粉酶的检测使用基于智能手机的传感器用于心理和生理学研究 （b）三层的唾液淀粉酶传感器。第一层是制备的电极衬底，第二层是双面胶带，使用激光切割机切割，第三层是一个亲水层，以方便样品的毛细作用。（c）为唾液淀粉酶检测反应步骤。

电压读取设备包括三个模块：电压放大模块、微处理器模块和USB传输模块（图S1dagger;）。电压放大模块将信号放大20倍，通过芯片接口采集电势差。微处理器模块负责信号的采样和模数转换，然后USB模块负责将数字信号发送到智能手机。

制作芯片时，需要在透明胶片上使用丝网印刷的方法印刷L-型的工作电极。接下来，使用银墨水滴在电极的末端形成伪参比电极，室温下完全干燥后，在顶层贴上激光切割成的双面胶层，最后在贴上亲水的底部。使用一片A4纸大小的胶片和其他材料可以切割出49块电化学芯片。芯片制作好后，配制含有0.02g/ml淀粉、100mM铁氰化钾和50mM氢氧化钠混合试剂。吸取2.5mu;l的反应试剂到通道中，然后避光在相对湿度75%、温度25℃的环境下干燥。芯片预载有试剂的情况如图S2dagger;。

图2（a）为唾液淀粉酶检测传感器的照片。唾液样品被引入到反应区，从进口的溶液与预装试剂反应，红色箭头表示。样品的颜色来自预装的铁氰化钾。4分钟后，该传感器被压在所指示的红色点的位置，并将样品推到检测区的电位测量。（b）照片显示整个检测系统，包括与唾液淀粉酶检测应用程序的智能手机、电位读取设备和传感芯片。电位的读取是通过USB端口连接到智能手，传感芯片连接到电位读取设备，按下智能手机触摸屏的红圈可引发唾液淀粉酶检测，最后，测试结果显示在屏幕上。

真实唾液样本的采集从下午开始（至少饭后两小时，避免食物消化的干扰）。实验过程符合赫尔辛基宣言。唾液收集的流程参考了Juan P. Saacute;nchez-Navarro的报道。在实验之前，所有被试者参与了预实验会话。会话中，他们书面阅读了实验过程的描述，然后在进行试验。实验前的10分钟不允许喝水，被试者需要清除口内的唾液，然后在两分钟积累新鲜唾液，然后采集5ml至聚苯乙烯试管内。

2.3 检测过程

唾液淀粉酶的检测需要首先将电压采集装置和手机连接（图2b），然后，将唾液样品吸入到毛细通道中，与试剂反应（图2a）。4分钟后，挤压芯片的特殊位置使溶液与电极接触测量电极电位，10秒钟后，唾液淀粉酶的测试结果将会显示在智能手机的屏幕上。

为了测试传感芯片的对于心里学实验的适用性，我们进行了一项实验，根据Juan P. Saacute;nchez-Navarro的报告进行了一些改动。实验中，将呈现两种不同的图片（来自于国际情绪图片系统），然后检测测试者前后的唾液，进行情绪上的分析。

3 结果与讨论

3.1 检测原理

整个传感系统由预载了试剂的传感芯片，电压读取器，安装了检测应用的Android智能手机组成。传感芯片上，将人体唾液的样本通过毛细作用吸取到反应区，唾液淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖，将导致碱性条件下铁氰化钾转变为亚铁氰化钾。当样品从反应区被引入检测区后，由于溶液中铁氰化钾与亚铁氰化钾浓度的差异，导致了电极电位差，该结果被采集然后通过USB发送到智能手机。手机上应用软件分析该电压，转化为体液淀粉酶的浓度。

传感器通道的末端是被堵死的，所以当唾液样品从入口进入之后，有部分空气被困在通道的末端，如图2a，按压该末端时，有空气的压力，唾液样本会从反应区被挤入到检测区。需要注意的是，反应区域必须足够长（大于2.8毫米），以防止空气从入口处泄露。毛细通道的高度必须小于250mu;m才能产生足够的压力。该设计的意义在于，允许芯片的样品与预加载试剂反应一段时间后再进入开放检测区域进行电压检测。这避免了预载试剂与电极之间可能的干扰情况（如铁氰化钾与银电极间的反应等）。

3.2 优化检测条件

3.2.1 铁氰化钾浓度

我们研究了铁氰化钾浓度对唾液淀粉酶检测的影响。我们制造了一系列传感芯片加载相同的试剂，但是不同量的铁氰化钾，用于分析包含250U/ml/的唾液淀粉酶样品。因为电势差是由铁氰化钾的量决定的，所以我们需要测量电位在2分钟和4分钟时的值来找出氧化还原反应带来的变化。如图3a所示，电势的改变随着铁氰化钾的浓度的提高而变大，当铁氰化钾的浓度达到100mM时，基本获得了最大的电势差变化。因此，选取该浓度为实验的最优浓度。

图3（a）在加入2.5 mu;L样品溶液包含250U mL-1的唾液淀粉酶到唾液淀粉酶检测芯片后，在2分钟到4分钟内铁氰化钾浓度变化时，电位差（Delta;E）作为应变量随着铁氰化钾浓度变化。芯片预装了2.5mu;L 0.010 M PBS溶液（pH 12）含有0.020克毫升-1淀粉和100 mM NaOH和不同浓度的铁氰化钾，并在测试前完全干燥。（b）为NaOH浓度不同时，测定4分钟时2.5mu;L含250 U mL-1唾液淀粉酶的样品溶液加到唾液淀粉酶检测芯片后的电位变化图。芯片预装了2.5mu;L 0.010 M PBS溶液含有0.02克毫升-1淀粉和100mM的铁氰化钾和不同浓度的NaOH，在测试前完全干燥。（c）将2.5mu;L含250 U mL-1唾液淀粉酶溶液加到唾液淀粉酶检测芯片后进行电位测定，观察5分钟内电位的变化。芯片预装了2.5mu;L 0.010 M PBS溶液（pH 12）含有0.020克毫升-1淀粉，100mM的铁氰化钾和50mM氢氧化钠，并在每次测试之前完全干燥。（d）将2.5mu;L样品加入检测芯片后，测量电位，得到样品浓度与反应时间的函数关系图。芯片预装了2.5mu;L 0.010 M PBS溶液（pH 12）含有0.020克毫升-1淀粉，100mM的铁氰化钾和50mM NaOH，并在每次测试之前完全干燥。

3.2.2 PH

众所周知，麦芽糖会在碱性条件下被铁氰化钾氧化，但是唾液淀粉酶水解淀粉的最适pH却是6.9，所以我们研究了氢氧化钠浓度对整体反应的影响，找到其中最适合浓度。同样我们预制备了一系列的传感芯片，预装了试剂，其区别在于试剂中氢氧化钠的浓度有所不同。这些传感芯片被用于分析包含有250U/ml的唾液淀粉酶的唾液样本，最后的电势在4分钟后测量。如图3b所示，对于0-100mM的范围内，电势差最明显的是50mM的情况，其他情况下由于酶的失活或者氧化程度的减弱，电势差的变化会受到影响而变小。因此，实验中的氢氧化钠最适浓度为50mM。

3.2.3 反应时间

传感芯片吸取唾液样本后就会催化加载试剂的反应，即唾液淀粉酶催化水解淀粉产生麦芽糖，然后再还原铁氰化钾，该反应随着时间的变化，电压变化呈现下降的趋势，这符合实验中的情况（图3c）。反应的时间越长，电势差的变化也就越大，但是也会带来不确定性的影响延长测试时间。这里我们使用4分钟来进行实验的整个反应过程。我们测量了芯片样品在反应4分钟的过程中电势差的变化。我们发现室温下，4分钟的反应过程中，大约14%溶液被蒸发。然而，由于根据能斯特方程，电势是受到铁氰化钾和亚铁氰化钾浓度之比的影响，也就是说，溶液的蒸发并不会引起测试结果的变化，除非试剂出现饱和。注意的是，预加载的淀粉在4分钟内并不会完全溶解（如图显示），但是淀粉的量是过剩的，淀粉没有完全溶解的必要，只需要足够的量供水解反应就可以了。

在反应区反应4分钟之后，唾液反应液被挤入检测区域。芯片上的电极电势差测量通过丝网印刷的石墨电极和银参比电极端获得。如图3d所示为电位的测量结果与实践的函数关系曲线，可以发现在20℃条件下，当反应时间超过4分钟之后，电压的变化较小，为了节约用户测试的时间，我们的测量到4分钟已经足够了。

3.2.4 温度 剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

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