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Membrane Organization and Cell Fusion During Mating in Fission Yeast Requires Multipass Membrane Protein Prm1
裂变酵母在交配过程中的膜组织和细胞融合需要多程膜蛋白Prm1
Curto, M.-Aacute;ngeles; Sharifmoghadam, Mohammad Reza; Calpena, Eduardo; De Leoacute;n, Nagore; Hoya, Marta; Doncel, Cristina; Leatherwood, Janet; Valdivieso, M.-Henar
摘要 裂殖酵母pmr1 在交配过程中参与细胞融合及其与该过程所需的其他基因的关系已得到解决。粟酒裂殖酵母Delta;prm1突变体在细胞相互作用区域表现出几乎完全的细胞融合阻断和质膜与细胞壁的异常分布。细胞包膜的分布类似于对缺乏相关的密蛋白样Dni蛋白的突变体的分布；然而，prm1 和Dni 基因在不同的亚途径中起作用。延时分析显示，在野生型粟酒裂殖酵母菌株中，磷脂酰丝氨酸在质膜细胞质小叶中的分布经历一些修饰，然后在细胞-细胞接触区域的交叉壁中开口。在Delta;prm1突变体中不发生这种膜修饰，并且交配配偶体之间的跨壁不会广泛降解；质膜形成内陷和指状物，有时塌陷或缩回，有时通过细胞壁材料的合成而加强。在含有和缺乏钙的培养基中细胞接触，Delta;prm1和Delta;prm1 Delta;dni合子都不会裂解。对抑制脂质合成或干扰脂质的药物的反应在野生型，Delta;prm1和Delta;dni1菌株中是不同的，表明膜结构/组织/动力学在所有这些菌株中都是不同的，并且Prm1p和Dni蛋白发挥一些保证正确的膜组织所需的功能，这对于细胞融合是至关重要的。
膜融合对于几个发育过程至关重要。酵母中交配的表征代表了理解细胞间膜合并及其调节所涉及的机制的有用工具。在裂殖酵母中，异型细胞属于两种交配类型之一，M（h-细胞）或P（h 细胞），而h90菌株是同源的 (Arcangioli and Thon 2004).。在富含培养基中，h 和h-细胞可以在不交配的情况下一起活跃增殖。当氮变得稀缺时，cAMP水平降低，这触发了性别分化所需的基因的表达。细胞停滞在G1并极化，产生称为shmoos的特化细胞(Yamamotoensp;et al.ensp;1997; Davey 1998; Nielsen 2004; Yamamoto 2004)。凝集后，分离两个亲本细胞的跨壁降解，允许细胞融合。有效的细胞融合需要正确组织细胞骨架 (Petersenensp;et al.ensp;1995, 1998a,b; Kurahashiensp;et al.ensp;2002; Doyleensp;et al.ensp;2009)。酿酒酵母FUS1和粟酒裂殖酵母FUS1 基因具有相同的名称，并且两种突变体在交配期间表现出细胞融合缺陷，导致预合子的积累（交配配偶体已建立稳定接触但尚未融合的交配中间体）。然而，相应的蛋白质是不相关的；而酿酒酵母Fus1p是膜蛋白 (Trueheartensp;et al.ensp;1987)，粟酒裂殖酵母 Fus1p为肌动蛋白在shmoo尖端补丁组织所需的formin (Petersenensp;et al.ensp;1995, 1998b)。粟酒裂殖酵母二倍体细胞核不稳定，因此核分裂后立即发生减数分裂，合子产生包含四个子孢子的子囊 (Nielsen 2004; Yamamoto 2004)。
使用氮饥饿和信息素处理进行的全基因组分析已被用于分析交配条件下的基因表达 (Mataensp;et al.ensp;2002; Mata and Bahler 2006)。对一些先前未表征的基因的研究表明其响应交配条件而诱导表达，从而表征了h 特异性凝集素图谱4 (Yamamotoensp;et al.ensp;1997; Mata and Bahler 2006; Sharifmoghadamensp;et al.ensp;2006)，和dni1 和dni2 ，Fig1相关的真菌密蛋白样蛋白家族的两个成员 (Clemente-Ramosensp;et al.ensp;2009)。由于细胞-细胞接触区膜组织与细胞壁重塑之间缺乏协调，dni1delta;和dni2delta;突变体表现出对温度敏感的细胞融合缺陷 (Clemente-Ramosensp;et al.ensp;2009).SPAP7G5.03基因编码具有与酿酒酵母Prm1 (Heiman and Walter 2000)22%相同的几个潜在跨膜结构域的蛋白质，在广泛分析中未被鉴定为交配诱导基因 (Mataensp;et al.ensp;2002; Mata and Bahler 2006)。在出芽的酵母中，PRM1响应信息素而被高度诱导，并且其缺失导致交配过程中细胞融合效率降低约50％。酿酒酵母prm1Delta;交配伴侣降解分离两个细胞的交叉壁，并且它们的质膜保持并列但不融合 (Heiman and Walter 2000)。在prm1Delta;合子中，当其中一个细胞的细胞质侵入另一个交配伴侣的细胞质部分时，就会产生细胞间的气泡和指状物，因为在没有细胞壁的情况下，附加的膜不能支持膨胀压力 (Heiman and Walter 2000; Jinensp;et al.ensp;2004)。人提出Prm1p是一种融合促进剂，可能有助于在交配对象之间的接触区域形成孔 (White and Rose 2001; Olmo and Grote 2010a)。粗糙脉孢菌具有PRM1直向同源物，其缺失导致营养细胞和性细胞融合期间细胞融合减少50%，在营养细胞融合期间出现具有相关质膜的细胞间气泡/手指，减数分裂后事件中的缺陷导致完全不育 (Fleissnerensp;et al.ensp;2009)。在酿酒酵母fig1delta;突变体中也观察到细胞间气泡/手指，这些突变体在促进钙内流的密蛋白样四跨膜蛋白中是有缺陷的，并且是交配期间细胞极化和融合所必需的(Erdmanensp;et al.ensp;1998; Mullerensp;et al.ensp;2003; Aguilarensp;et al.ensp;2007)。
细胞融合是具有挑战性的过程，需要重组细胞包膜。酿酒酵母的prm1Delta;细胞在交配过程中经历了接触依赖性裂解。钙耗竭会增强prm1Delta;和fig1Delta;突变体中的裂解，而prm1Delta;中FIG1Delta;的缺失会增强细胞融合缺陷，而不是合子裂解。有人提出，钙将促进质膜修复机制，从而弥补Fig1p和Prm1p的缺乏。尽管关于酿酒酵母 Prm1p 的信息很多，但其性质功能仍然未知。
酿酒酵母和粟酒裂殖酵母是远缘相关的酵母，因此针对两种生物交配的研究可能有助于了解参与该发育过程的蛋白质的保守和发散功能。在这项工作中，我们分析了粟酒裂殖酵母prm1 在交配中的作用及其与细胞融合中涉及的其他基因的关系。我们已经证实prm1 在交配过程中被上调，并且发现Prm1p定位于shmoos的顶端。在prm1Delta;突变体中，分隔交配伴侣的横壁不会被广泛消化，质膜会形成内陷/指状物。在某些前合子中，在融合区会产生新的细胞壁材料，因此这种结构经历的杂化与在dniDelta;合子中观察到的相似。但是，遗传分析表明，prm1 和dni 基因的功能是独立的。磷脂酰丝氨酸在质膜内小叶上的行为以及对干扰脂质的药物的响应表明，在营养生长和交配过程中质膜的结构/组织/动力学是不同的，而在野生型中质膜的结构/组织/动力学是不同的， dni1Delta;和prm1Delta;菌株。这些结果表明Prm1p和Dni蛋白发挥维持适当的膜组织所需的不同功能，并且这些功能与细胞融合特别相关。
材料和方法
菌株和生长条件
先前已经描述了所有一般生长条件和酵母操作。粟酒裂殖酵母菌株是972H-和975H 野生型（WT）菌株的衍生物，并且在具有补充剂（YES）或爱丁堡基本培养基（EMM）的酵母提取物中生长。通过消除CaCl2并用泛酸钠代替泛酸钙来制备EMM-Ca。需要时，向该培养基中加入不同浓度的钙，BAPTA（Sigma）和EGTA（Sigma）。EMM-N是不含氯化铵的EMM，并用去离子水制备。遗传霉素（G418，Formedium）和神经灵霉素（Werner Bio
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