白背飞虱卵黄原蛋白及其受体的分子特征和在卵母细胞成熟中的作用外文翻译资料

 2022-12-30 11:06:23

白背飞虱卵黄原蛋白及其受体的分子特征和在卵母细胞成熟中的作用

摘要：卵黄蛋白前体（Vg），即卵黄原蛋白，为胚芽发育提供营养，而卵黄蛋白原受体（VgR）负责通过卵母细胞的成熟来吸收卵黄蛋白。这两种蛋白是昆虫中与繁殖相关的关键蛋白。我们克隆和表征了白背飞虱的Vg和VgR基因并研究了它们在卵母细胞成熟中的作用。克隆的SfVg和SfVg有6114和5796 bp的开放阅读框，分别编码2037和1931个氨基酸残基。结构分析表明，SfVg有三个保守的结构域，分别为LPD_N，DUF1943和VWFD，SfVgR包含了LDLR超家族的所有保守基序。两种基因都在成年雌性白背飞虱中有高的表达量。SfVg在脂肪体内表达量最高，而SfVgR主要在卵巢中表达。敲除这两个基因中的任何一个基因都会使卵母细胞中的卵黄蛋白沉积减少并阻止卵母细胞的成熟。但是，使这两个基因中的一个基因沉默不会影响另一个基因的转录水平。这些结果证明了SfVgR在转运SfVg到卵母细胞中的作用。SfVg和SfVgR都是白背飞虱(Sogatella furcifera)卵母细胞成熟必不可少的基因，这两个基因都可能被作为控制这种害虫的手段的基因。

关键词：白背飞虱; 卵黄原蛋白; 卵黄原蛋白受体; 繁殖; RNA干扰

前言

卵巢发育对于卵生昆虫的繁殖至关重要[1]，胚胎发育需要大量的卵黄蛋白。卵黄原蛋白（Vg）是卵黄蛋白的前体，主要在脂肪体内合成，经糖基化、磷酸化、蛋白水解裂解、硫酸化成糖脂蛋白并裂解成大大小小的亚基后释放到血淋巴中[2]。Vg被卵黄原蛋白受体（VgR）介导的胞吞作用吸收到发育中的卵母细胞中[3]，再通过VgR转运到受体细胞，在VgR中它提供胚胎发育必不可少的营养素[4]。

在昆虫中，不同物种之间存在一到三个Vg基因[5-7]。Vgs是约为200kDa的大蛋白分子[8]，属于脂质转移蛋白（LLTP）超家族，通常具有约20个残基左右的信号肽，一个N端的脂质结合结构域（LPD_N），一个功能未知的结构域（DUF1943）和一个C端的血管假性血友病因子D型结构域（VWD）[2,9-11]。大多数昆虫只有一个VgR基因编码一个分子量为180–214kDa的多肽[12]。VgR属于低密度脂蛋白受体（LDLR）家族[13,14]。VgR的氨基酸序列包含了五个高度保守且功能不同的氨基酸结构域，一个配体结合结构域（LBD），一个表皮生长因前体结构域（EGF），一个O型糖结构域，低密度脂蛋白受体Tyr -Trp-Thr-Asp（YWTD）重复和一个跨膜结构[11-13,15]。

已发现卵黄原蛋白有多种非生殖功能，例如区分群居昆虫的工种和饲用种以及调节荷尔蒙动力、免疫力和味觉响应能力的变化[16-20]。但是，Vg的主要作用是形成蛋黄蛋白并提供胚胎发育所需的营养。有充分的证据表明，Vg和VgR对于昆虫的成功繁殖至关重要。例如，在褐飞虱(Nilaparvata lugens)中，dsRNA介导的NlVg和NlVgR沉默抑制了卵巢的发育，从而导致不育[21]。同样，在桔蚜(Aphis citricidus)中，AcVg和AcVgR的dsRNA敲低会对胚胎发育和胚胎后发育产生负面影响[11]。

白背飞虱是一种高度繁殖力的昆虫，对亚洲的稻米作物造成重大损害。这种半翅目害虫以水稻的韧皮部汁液为食，如果侵害足够严重，则会导致延迟分蘖，谷物萎缩，生长发育迟缓和植物死亡[22,23]。此外，白背飞虱是南方稻米黑条纹矮化病毒（SRBSDV）的载体[24]，而SRBSDV使水稻植株产生很少或没有水稻粒的小穗，从而大大降低了水稻的产量[25]。通过控制病媒来控制植物病害是具有战略性意义的[26]。卵巢发育对于害虫的繁殖至关重要，因此，破坏卵子发生的特定步骤可能成为控制害虫种群的一种方式。

我们首先克隆了白背飞虱 Vg（SfVg）和VgR（SfVgR）序列，分析了它们的基本分子和结构特征，并与其他昆虫进行了比较。此外，我们评测定了SfVg和SfVgR在不同组织和发育阶段的表达模式。最后，我们使用dsRNA介导的基因沉默来确定Vg和VgR在白背飞虱卵母细胞成熟中的作用。

材料和方法

昆虫采集与饲养

白背飞虱是从长沙湖南农业大学的一个水稻田中采集的，在温度为26plusmn;1℃，相对湿度为80plusmn;5％的气候室中，以及16plusmn;8h（L：D）光照条件下，在Fengyou No.9水稻幼苗上培育了3代以上。

随机选择昆虫：一龄（30只），二龄（30只），三龄（15只），四龄（10只），五龄（10只）和96h的雌性（5只）和雄性（5只）的样本，来测定不同龄期昆虫整个机体SfVg和SfVgR的表达量。同时测定0、24、48、72、96和132h成年雌性昆虫（每个龄期5只）的整个机体SfVg和SfVgR的表达量以及 96h成年雌性昆虫（20只）的头部、胸部、中肠、卵巢和脂肪体中SfVg和SfVgR的表达量，每个样品有三个重复。

RNA的分离与cDNA合成

使用MiniBEST通用RNA提取试剂盒（TaKaRa，大连，中国）提取总RNA。根据制造商的说明，使用带有gDNA Eraser（TaKaRa）的PrimeScriptTM RT试剂盒来合成20micro;l反应混合物中有0.5micro;g总RNA的第一链cDNA。

序列比较和系统发育分析

SfVg和SfVgR的序列来源于转录组数据和公开的基因组序列[27]，并使用美国国家生物技术信息中心NCBI1网站上的在线BLAST程序进行了鉴定，使用SMART2程序分析了SfVg和SfVgR的模块结构域，使用计算pI / Mw3工具预测了这两个蛋白质序列的pI / Mw，使用NetNGlyc1.0 Server4（NXS / T）识别糖基化位点，使用NetPhos3.1 Server5预测磷酸化位点，使用TMHMM Server v2.06预测跨膜（TM）区域。

从GenBank数据库中下载了其他昆虫的32种Vgs氨基酸序列和35种VgRs氨基酸序列，这32个Vgs和35个VgRs的名称和GenBank编号列在补充文件1中。使用ClustW来比对氨基酸序列，然后使用MEGA5.0构建具有1000个自展重复的种系发生系统树 [28]。

SfVg和SfVgR的发育表达谱

定量RT-PCR（qRT-PCR）检测SfVg和SfVgR的表达水平，使用TB Green Premix Ex TaqTM II（TaKaRa），在CFX96 TouchTM实时PCR检测系统（Bio-Rad,Hercules,CA,United States）95℃变性30秒， 随后在95°C下进行40times;5s循环，最后在60°C下进行30s的条件下进行qRT-PCR。每个基因的qRT-PCR引物均使用NCBI profile server27设计，引物及其扩增效率如表1所示。靶基因的相对表达水平通过使用2-∆∆Ct方法通过将其CQ值标准化为alpha;-1微管蛋白（SfTub，登录号NO.KP735521）和延伸因子1alpha;（SfEF1alpha;，登录号NO.KP735517）来计算,和之前的研究一样[29-32]。每个样本有三个技术重复。

1https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

2http://smart.embl-heidelberg.de/

3https://web.expasy.org/compute_pi/

4http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/

5http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/

6http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/

7http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast

RNA干扰

RNA干扰用于研究SfVg和SfVgR在卵母细胞成熟中的功能，以EGFP基因（增强型绿色荧光蛋白，GenBank登录号NO.U55762）作为平行对照。对于dsRNA制备，首先使用与T7 RNA聚合酶启动子序列缀合的特异性引物（表1）扩增SfVg、SfVgR和EGFP基因。根据制造商的规定，利用T7 RiboMAX Express RNAi系统（Promega，Madison，WI，United States），将所得的PCR产物用作模板来合成dsRNA（dsVg，dsVgR和dsEGFP的长度分别为541、526和441 bp）。将新生的成年雌性白背飞虱用CO2麻醉90 s，然后将100 ng （50 nL，2000 ng / micro;L；根据初步测试）的dsRNA用纳米注射器（Drummond Scientific, Pennsylvania, PA, United States）通过胸部和间胸之间的结膜注入机体[33]。随机选择五只昆虫的三个重复样本以评估注射后48、72和96 h RNAi处理的效率。注射后132小时后，用配备D3400数码相机（Nikon, Tokyo,Japan）的立体显微镜 (Motic SMZ-161, Motic Group Co., Xiamen,China)观察并拍摄每个实验组中超过20只雌性个体的卵巢表型。

数据分析

通过单向方差分析（ANOVA），然后采用Tukey的显著性差异检验对多个样本进行比较，评估不同发育阶段和组织中SfVg和SfVgR表达水平差异的统计学显著性（P lt;0.05）。RNAi实验组和对照组之间基因表达差异的统计学显著性使用Studentrsquo;s t-test 进行评估（* P lt;0.05，** P lt;0.01，** P lt;0.001）。使用GraphPad Prism 8（GraphPad Software Inc., San Diego, CA, United States）进行统计分析。所有数据均表示为平均值plusmn;标准误差（SE）。

结果

SfVg的序列和结构

从转录组数据中鉴定出SfVg的序列，SfVg（GenBank登录号NO.MN229743）的开放阅读框（ORF）编码2037个氨基酸序列，理论等电点（pI）为8.43，预测的分子量（Mw）为226.6 k

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

英语原文共 9 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[275523]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word

原文和译文剩余内容已隐藏，您需要先支付 30元 才能查看原文和译文全部内容！立即支付

发小红书推广免费获取该资料资格。点击链接进入获取推广文案即可： Ai一键组稿 | 降AI率 | 降重复率 | 论文一键排版

您可能感兴趣的文章