可注射骨生物材料用纳米级丝状羟基磷灰石水凝胶外文翻译资料

 2021-10-26 10:10

英语原文共 9 页

可注射骨生物材料用纳米级丝状羟基磷灰石水凝胶

Zhaozhao Ding, Hongyan Han, Zhihai Fan, Haijun Lu, Yonghuan Sang, Yuling Yao, Qingqing Cheng, Qiang Lu, and David L. Kaplan

苏州大学生物与基础医学院与苏州纳米科技合作创新中心，中华人民共和国苏州苏州市苏州大学现代丝绸国家工程实验室，中华人民共和国苏州市苏州市苏州大学附属第二医院骨科，美国马萨诸塞州梅德福德塔夫茨大学生物医学工程系

摘要：可注射水凝胶系统是骨的重要组成部分。因处理不当而替代再生-扎带和填充不规则缺陷的能力。丝-羟基磷灰石水凝胶中丝状纳米纤维复合材料制备并用作成骨的生物材料。

这些触变丝纳米纤维水凝胶和水分散性将真丝-透明质酸纳米粒子混合形成可注射纳米。-

高公顷均匀分布的尺度系统含量【60%（w/w）】模拟骨生态位。模数在系统，为诱导骨分化提供物理线索。复合水凝胶支持改善成骨与丝纳米纤维水凝胶相比。在植入丝状-羟基磷灰石复合水凝胶后，检测到新形成的骨组织和骨缺损愈合情况，这表明丝状-羟基磷灰石复合水凝胶对不规则骨缺损的再生具有实用性。

关键词：注射性；羟基磷灰石；丝素；骨再生；仿生

  1. 背景介绍

由于外伤、异常、骨折不愈合、感染或肿瘤切除而造成的大的颅骨缺损仍然是修复的一大挑战。1 - 4自体或异体骨移植已被广泛应用于骨缺损的修复，并取得了令人印象深刻的功能恢复。然而，这些方法的成功率受到几个固有缺点的抑制，包括供体位置的发病率和感染。5 - 7因此，已经考虑用诸如支架、凝胶、骨水泥和来自合成和天然生物材料的粉末等移植物替代品来替代或修复受损的骨位置。8 - 11包括钛合金、镁合金和不锈钢在内的骨代用品因其良好的力学性能而被广泛应用于骨缺损的修复。12 - 15然而，这些替代物与周围骨骼之间的机械不匹配通常导致向正常骨骼的修复受损。缺乏组织粘附和腐蚀金属离子的积累也对更好地恢复功能提出了挑战。16 - 18近年来，生物活性人工骨被开发出来，用于诱导受损部位的新骨再生。19，20尽管这些人造骨骼的性能不如正常骨骼，但它们为加速骨骼修复和功能恢复提供了线索和首选的微环境。值得注意的是，通过调整这些人造骨的成分，使其像ECM这样的纳米纤维结构转变，并可调节生长因子的传递，从而实现了更好的骨再生。21 - 24除了改善结构和生物活性外，临床应用的可注射性特征，以减少对周围组织的损伤程度，缩短手术时间，加速损伤部位的恢复，也是很有吸引力的选择。25 - 27然而，注射性的改善往往会损害生物活性，因此仍然是一个挑战。

蚕丝蛋白是从家蚕中提取的一种天然蛋白，具有生物相容性好、可调节生物降解性、易加工等优点，在生物医学领域得到了广泛的应用。通过调整成分、力学性能和生长因子的传递，优化了28 - 30丝质骨支架。尽管丝基材料被认为是有希望的骨再生基质，但对可注射骨材料的研究较少。以丝基材料填充不规则骨缺损，通过微创手术可以解决目前需求的显著缺口。近年来，本课题组制备了注射用丝素纳米纤维水凝胶，并将其作为载体释放抗癌药物，为设计基于丝的注射用生物活性人工骨生物材料提供了可能。同时，骨的主要矿物相羟基磷灰石(HA)具有良好的骨传导性，并与丝素蛋白混合形成多孔结构的复合支架，改善了骨诱导作用。因此，采用丝素蛋白纳米纤维和HA纳米颗粒设计了可注射性人工骨生物材料。将水分散的HA纳米粒子与丝素纳米纤维共混，形成丝素- HA复合水凝胶。调整HA纳米颗粒和丝素纳米纤维的比例，以获得与天然骨相似的机械性能和有机-无机复合材料，同时保持注射能力，使用这些水凝胶在体内和体外都证明了成骨能力的显著提高。

  1. 材料与方法

2.1 水蚕丝溶液的制备

采用传统的溶出工艺制备丝素溶液。简单地说，生丝在0.02M的Na2CO3水溶液中煮沸20分钟，然后用蒸馏水彻底冲洗，提取丝胶蛋白。提取的丝素纤维在60°C的9.3 M溴化锂溶液中溶解4 h，用透析管(分子量截止3500)对蒸馏水透析72 h，除去盐份。在4℃下，以9000 rpm离心20 min，除去在此过程中形成的丝骨料，制备出浓度为~ 6% (w/v)的光学透明丝素溶液，干燥后称量剩余的固体重量。

2.2 丝素包被HA纳米颗粒形成

以丝素蛋白为模板和表面稳定剂，采用水沉淀法制备了丝素包覆HA纳米粒子。将上述化学物质分别溶解于蒸馏水中，制备了32种Ca(OH)2 (0.02 M)和H3PO4 (0.06 M)水溶液。新鲜丝素蛋白溶液(6 wt %)在60℃孵育24 h，得到均匀的纳米粒子。将20ml H3PO4溶液与20ml丝素蛋白溶液混合，形成丝素蛋白- H3PO4混合溶液。然后将混合溶液滴加到100ml Ca(OH)2悬浮液中，速度为90ml hminus;1，剧烈搅拌。溶液在70°C的水浴中加热，然后将溶液pH调整为sim;9,NaOH浓度为0.1 M。最后，以9000 rpm离心20 min，用蒸馏水轻洗，回收丝素包覆的HA纳米粒子。

2.3 丝素纳米纤维的形成

通过最近报道的浓度稀释法合成了丝素纳米纤维。在60℃下，溶液(6 wt %)在24小时内缓慢浓缩至sim;20 wt %，形成亚稳态纳米颗粒，然后用蒸馏水稀释至2 wt %。将稀释后的丝素溶液在60℃下孵育24 h，诱导纳米纤维形成。丝素纳米纤维被称为SF。

2.4 SF - HA复合水凝胶的制备

以SF - HA为原料，经连续搅拌均匀制备SF - HA复合水凝胶。含有20、40和60% HA颗粒的水凝胶分别称为SF - HA20、SF - HA40和SF - HA60。

2.5 SF - HA水凝胶的特性

用扫描电子显微镜(SEM) (S-4800, Hitachi, Tokyo, Japan)对SF、HA和复合水凝胶在3kv下的微观结构进行了表征。在成像之前，样品被安装在铜板上，并涂上一层金。使用Nicolet FTIR 5700光谱仪(Thermo Scientific)对样品进行傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析。红外光谱记录范围为4000 ~ 500 cmminus;1。X射线衍射(XRD)(纳米ZS90莫尔文仪器,莫尔文,英国)之间的分析值，使用全色盲者铜K辐射(30 mA, 40 kV)的扫描速度6。/min确认特征衍射峰的科幻和HA复合。 SF和SF - HA复合水凝胶的SEM图像、(B) FTIR光谱和(C) XRD曲线。A图a - d部分显示了SF、SF - HA20、SF - HA40和SF - HA60的微孔结构，a1 - d1部分显示了蚕丝纳米纤维和HA纳米颗粒在水凝胶中的分布。

2.6 水凝胶的流变学研究

水凝胶的流变行为是在装有20毫米锥形板(Ti, 20/1°)的流变仪(AR2000, TA Instruments, New Castle, DE)上测量的。在25°C时，在100到1 rad sminus;1的宽频率范围内连续收集扫频信号。通过测定在22 ~ 40℃等频率下的流变行为，评价了SF - HA复合水凝胶和SF - HA复合水凝胶的稳定性。

2.7 水凝胶的粘度和可注射性

在10 - 1到10 - 2 s - 1的不同剪切速率下，绘制SF和SF - HA复合水凝胶的粘度，以获得室温下的流动曲线。将不同的水凝胶吸入1 mL注射器中，不需要针头或通过1.5 N以下的针头(27号针头)将水凝胶推出，以评估37°C下的可注射性。然后用反演研究方法对水凝胶的稳定性进行了评价。一个5毫升的水凝胶被放置在圆柱形的瓶子里，瓶子底部是平的，瓶子被倒过来放在瓶盖上。分别于10 min、2 h、60 h、100 h时观察水凝胶的流动。

2.8 水凝胶的体外生物相容性

雄性Sprague- Dawley (SD)大鼠(sim;40g)被安乐死，并在无菌条件下用于分离骨间充质干细胞(rBMSCs)。将rBMSCs接种于含10%胎牛血清和100单位/mL青霉素链霉素(Gibco, Grand Island, NY)的DMEM细胞培养皿中，连续传代至第三代。为了研究细胞增殖，将rBMSCs以每孔5times;105个细胞的密度接种于含有完整DMEM的6孔板中。细胞融合后，去除DMEM。在指定的时间点(1、3、5、7天)，用蛋白酶K在56℃下过夜。然后根据制造商的协议(Invitrogen, Carlsbad, CA)，使用PicoGreen DNA分析方法评估DNA含量。

2.9 细胞分化

研究细胞分化,通过3 bmsc被播种在玻片24-well板DMEM含有10%的边后卫和100单位/毫升penicillin-streptomycin (Gibco)和培养24小时，然后被移除。媒介与成骨的交换介质(低糖DMEM，streptomycin-penicillin 1%, 10 nM地塞米松，10毫米钠甘油磷酸盐，抗坏血酸和0.05毫米2-phosphate) 7、14、21天。碱性磷酸酶(ALP)是一种位于细胞表面的糖蛋白，是公认的成骨细胞分化的标志物。38不同骨水平基因表达标记，Runx2(成骨的成熟的早期标志)39minus;41和骨钙蛋白和骨桥蛋白(后来成骨分化和矿化的标志)，42，43测量评估bmsc的分化状态使用定量实时聚合酶链反应(PCR)，所有的测量都是用我们最近的研究中报道的方法进行的44。

采用免疫荧光法检测骨特异性蛋白ALP、骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)的表达。24在孔板玻璃载玻片上培养rBMSCs，采用成骨培养基，细胞分化。7天后标记抗ALP抗体，观察ALP的表达情况。通过标记抗OCN (Abcam, Cambridge, MA)和抗OPN (Boster, Pleasanton, CA)抗体，21天后检测OCN和OPN的表达。样本短暂固定在4%多聚甲醛溶液30分钟，Triton x-100渗透率保持10分钟，0.1%与PBS清洗三次，加入抑制3%牛血清白蛋白(BSA)1 h。细胞孵化与主抗体在一晚上稀释后遵循规则，二级抗体为山羊抗小鼠IgG (Abcam)和山羊抗兔IgG (Abcam)与荧光素异硫氰酸酯(FITC)结合(Thermo Fisher, Waltham, MA)。所有样品均用四甲基罗丹明(TRITC) (Thermo Fisher)与phalloidin偶联对F-actin染色，最后用核DAPI染色，激光共聚焦显微镜分析37。

2.10 体内动物研究

如前文所述，在大鼠颅骨缺损模型中检测了SF - HA水凝胶的体内骨形成能力。9 – 11，45采用36只8周龄雄性SD大鼠(sim;300 g)，随机分为4组: SF、SFminus;HA20、SFminus;HA40和SFminus;HA60。采用4%水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠。在颅骨上作矢状面中线皮肤切口，取全层皮瓣抬高皮肤及骨膜。当用0.9%的盐水冲洗骨时，用牙钻在颅骨的每一顶骨中心制造出临界大小的全厚度骨缺损(直径5毫米)，骨缺损处填充了水凝胶。手术后，将大鼠单独关入笼中喂养。第8、12、16周处死大鼠，取骨标本。（所有程序均经苏州大学动物伦理委员会批准）在每个时间点，颅盖标本收集和固定在10%中性缓冲福尔马林中24 h，然后是颅盖标本被体内扫描x射线microcomputed断层扫描(mu;CT)。

固定后,三维(3 d)图像被使用mu;CT扫描仪(Aartselaar SkyScan SkyScan 1176年,比利时)在18mu;m决议,65千伏的电压和电流381mu;A分析新骨形成。采集的三维扫描图像用CTan (SkyScan)进行重建和分析。之后进行mu;CT成像和分析，收集样本准备组织学分析。固定标本在pH 7.4下用10% EDTA脱钙1个月。经一系列乙醇溶液脱水，石蜡包埋。切片采用苏木精、伊红(HE)染色，免疫组化靶向OCN (Abcam, ab13420, 1:20 00)和骨桥蛋白(OPN, Abcam, ab8448, 1:50 00)，如前所述。29，45

2.11 统计分析

多组比较采用SPSS 16.0版进行统计分析，数据集均值的比较采用单向方差分析。除另有规定外，测量方法以均数plusmn;标准差表示。ple;0.05被认为是显著的。

  1. 结果与讨论

3.1 水凝胶结构

纳米丝纤维水凝胶的可注射性为设计可注射仿生丝HA人工骨基质提供了可能。在丝纳米纤维水凝胶中加入31 HA纳米粒子，制备注射基质。虽然以天然骨的无机/有机比例为基础优选较高的HA含量(gt;50 wt %)，但在较高HA含量下，如何避免HA的聚集，保持复合水凝胶的注射性仍然是一个挑战。近年来，以蚕丝为模板和稳定剂制备了水分散HA纳米粒子，并用于设计蚕丝- HA支架材料。29,32 HA纳米颗粒在40% HA含量的丝质基质中均匀分布，表明该纳米颗粒可能是设计可注射仿生丝- HA水凝胶的合适候选材料。

因此，将不同量的HA纳米粒子与丝纳米纤维水凝胶混合，以评估复合水凝胶形成的可行

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