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通过基因改造提高根瘤菌-豆科植物共生系统的铜污染修复能力

Eloiacute;sa Pajuelo, Patricia Peacute;rez-Palacios, Asuncioacute;n Romero-Aguilar,

Juliaacute;n Delgadillo, Bouchra Doukkali, Ignacio D. Rodriacute;guez-Llorente

and Miguel A. Caviedes

摘要

土壤中存在过量的铜代表环境健康出现了问题,这种情况一般是由地下水污染引起的。此外，铜污染会影响植物生长和植物的产量。植物修复作为一种低成本、生态环保的重金属污染修复技术得到了广泛的应用。在这种特殊的情况下，豆类植物-根瘤菌共生体系已成为一种具有吸引力的用于金属植物稳定化的生物修复工具。为了使这种技术更合适实际情况，需要具有耐金属污染的共生体，而这种共生体可以通过基因工程产生。在本研究中我们介绍了一种修复铜污染的共生体的基因改造过程。在植物苜蓿的基础上，加入了从拟南芥中提取了表达金属硫蛋白基因mt4a的复合物，以期提高植物对铜的耐受性。对于根瘤菌的菌株，用基因工程手段在中华根瘤菌中加入铜绿假单胞菌的铜抗性基因。我们的结果表明:(a)复合植物中mt4a的表达增加了对Cu的耐受性，并减少了该污染物引起的氧化应激。我们在表达mt4a的植物中发现了低量的活性氧清除酶。(b)复合植物中mt4a的表达改善了结瘤，而与转基因中华根瘤菌的接种具有协同效应; (c)双共生系统可提高根系的铜积累，而不增加金属易位。我们认为，转基因共生体系是一种合适的铜污染植物稳定修复工具。

关键字：蒺藜苜蓿 根瘤菌 植物修复 重金属 金属硫蛋白mt4a 铜抗性基因

1引言

铜在土壤中的存在可能是由于自然的生物地质过程导致的，但是大多数土壤中的铜都是由于人类活动的造成，例如采矿、工业制造铜线、电池和电子微芯片，以及农业中使用的杀虫剂。

铜在植物中具有双重身份，它既是一种微量元素，又是一种有毒物质，它的利弊取决于它存在于土壤中的的浓度。铜作为一种微量元素，参与植物的多种生理反应过程，如光合作用、线粒体反应、细胞壁代谢、花粉管发育和乙烯感知等。然而，植物体内的铜浓度过量会抑制植物的萌发，生长和光合作用，并引起强烈的氧化应激反应。此外，在豆科植物中，即使是低铜浓度，也会抑制植物根结瘤，减少结节数量和结节质量，影响根毛生长。

在过去的十年中，豆科植物与耐金属的根瘤菌结合共生体系治理铜污染已成为植物修复土壤重金属污染的一个极具吸引力的技术。为了使这种技术更适用，共生体系必须有较高的金属耐受性。一般来说，豆科植物有适度的金属耐受性。此外，因为嫩芽的易位因子低所以豆科植物的重金属积累在根中。由于具有金属抗性的根际微生物，特别是根瘤菌的存在，豆科植物中重金属过量存在所带来的应力可能会减弱。

当豆科植物或根瘤菌没有足够多的金属耐受性时，基因工程可以改造它的基因。众所周知，在转基因植物中金属硫蛋白基因的表达会增加对铜的抗性和累积性。除了与铜结合，金属硫蛋白还在活性氧簇的清除和解毒中起作用。基因改良的根瘤菌增强了对铜和镉的抗性。

在这项研究中我们已经前进了一步，获得了具有金属铜植物稳定化的双重转基因共生系统：表达金属硫蛋白基因mt4a的苜蓿和表达铜绿假单胞菌的铜抗性基因的中华根瘤菌。我们对植物生长、结瘤、氧化应激和铜积累情况进行了研究评价。

2材料和方法

2.1基因改良共生体的产生

复合植物蒺藜苜蓿是经过携带以拟南芥中mt4a为目的基因的发根土壤杆菌为载体感染所产生的。然后使用卡那霉素选取转基因根系。基因改良的中华根瘤菌表达了荧光假单胞菌的基因copAB。

2.2植物生长条件和接种

在经过卡那霉素选择后，将选择出的复合植物种植在在无菌透明容器中，土壤为沙：蛭石比为3:1。在容器盖子处有气体交换过滤器。首先用50ml的缓冲介质（没有氮源）和浓度依次增加的铜溶液（50、100、200micro;M）浇灌植物。接着用基因改良的中华根瘤菌接种植物。容器被放置在室内温度为20-24°C的条件下生长，见光时间为12小时每天。15天后，在无菌条件下，再添加25 mL的BNM培养基(不添加Cu)。保持容器内的湿度，总生育期为一个月。

2.3植物生长量和结瘤的测定

采集植物，测定结节数量。切断芽和根被，测量生物量和长度 (一般测20-24株)。将一半的植物放在温度为80℃的干烤箱中，然后测定植物干重和植物中铜的积累量。另外一半在液氮中均质化，并储存在-80 ℃的环境下直到使用。

2.4测定抗氧化酶

根据Sosa-Alderete 等人(2009)的研究，对植物芽的粗提取物中超氧化物歧化酶(SOD)、总过氧化物酶(PX)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)进行生化测定。根据Bradford (1976)的研究确定了蛋白质。具体活动的结果是三个独立的决定因素。

2.5植物组织中铜的积累分析

收取植物，用蒸馏水洗净并放在80 °C烘干箱中烘干直到干重不变。用ICP-OES法测定植物组织中铜含量。

2.6统计分析

植物生长和结瘤的数据是指20-25株植物的数据plusmn;标准偏差。铜积累的数据指8种植物在三种浓度下铜浓度plusmn;标准差的数值。酶活性的数据指三种铜浓度下数值plusmn;标准差决定。统计分析采用单因素方差分析，DMS事后检验p lt; 0.05。

3结论

3.1共生系统在铜的的胁迫下的生长情况

铜的存在降低了植物的生长速率，特别是在200 M浓度的时候(图16.1a)。根系的长度和生物量减少，同时也减少了嫩芽的生物量。我们观察到在自然的伴生条件下，mt4a的表达是保护根系生长受铜抑制的最主要因素(图16.1b)。接种基因改良的中华根瘤菌在植物的根系中生长的影响较小。

3.2对结瘤的影响

图16.1铜溶液浓度的增加对不用共生系统生物量的影响(1:WT/WT;2:MT4a / WT;3:WT / copAB;4:MT4a / copAB)。a表为根长度 (厘米)。b根生物量(毫克/植物)。c嫩芽生物质量(毫克/植物)。野生型共生(左)与双基因改良共生系统(右)在200 Cu溶液的存在下进行比较。

表16.1 为普通共生系统（WT/WT）、未改基因植物接种转基因中华根瘤菌系统（WT/copAB）、转基因植物接种未转基因中华根瘤菌系统（MT4a/WT）和全转基因系统（MT4a/copAB）在不同Cu浓度下植物的结瘤数量。

用200mu;M铜溶液浇灌的自然伴生的共生系统中，结瘤数量减少了80%。mt4a的表达保护了结瘤的减少，因为在复合改基因植物中，结瘤率降低了60%。复合植物与改基因中华根瘤菌接种具有协同效应，因为在用200 M 铜溶液浇灌的改基因共生系统中，结瘤率仅下降20%。此外，X-galX-gal的存在证实了报告基因lacZ的表达(图16.2)。蓝色表明这些小结节是由改良的微共生菌引起的。由于基因copAB位于启动子的远端位置，位于启动子的近端位置的lacZ的表达表明了copAB的正确表达。

图16.2转基因中华根瘤菌引起的结节表示铜抗性基因成功表达.由于beta;-galactosidase的催化引起的蓝色表明了位于启动子末端的copAB基因的成功表达.

3.3铜存在下的氧化酶活性

为了评价不同共生体的氧化应激，测定了共生系统的抗氧化酶活性。结果如图16.3所示。对过氧化氢酶活性(图16.3),野生型共生的活动增加了5倍的100 - 200mu;M铜。与双改良共生相比，mt4a的表达与改良根瘤菌株的接种在降低该酶水平上有协同作用。在全过氧化物酶活性(图16.3b)和超氧化物歧化酶活性(图16.3)中观察到相似的结果。采用野生型根瘤菌株接种的野生型植物，与野生型根瘤菌株的转基因根系结合，表现出中间酶水平。相反，抗坏血酸过氧化物酶表现出不同的模式;无论是mt4a的表达还是基因改良的根瘤菌菌株的接种，都导致了野生型伙伴关系的重大变化。一般来说，结果表明野生型共生显示了所有酶的最高水平，特别是在200 M。这些结果可以被解释为具有最低氧化应激水平的双改良共生，而野生型植物和转基因根瘤菌或野生型根瘤菌和转基因根的组合导致了中等水平的压力。

图16.3表示了四种系统在氧化应激过程中四种不同氧化酶的含量。

3.4铜含量的测定

铜含量的测定(表16.2)表明,在植物组织中铜的积累量在浓度为100和200um的情况下略有增加。然而在接种转基因中华根瘤菌的植物跟根系中铜的积累量明显增加，接种转基因中华根瘤菌是影响Cu根积累的最重要因素而mt4a的表达只有轻微的协同作用(表16.2)。在计算TF时(表16.3)，数据显示根接种后的根的最低值，表明该转基因方法在铜植物稳定性方面的有效性。

表16.2不同铜浓度下不同系统根和嫩芽对铜的积累量

嫩芽

根

表16.3不同铜浓度下不同系统植物的根接种后的根的最低值

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