DNA和石墨烯作为捕集亚甲基蓝（MB）的新平台：β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的电催化氧化的研究外文翻译资料

 2022-08-06 09:08

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DNA和石墨烯作为捕集亚甲基蓝（MB）的新平台：beta;-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的电催化氧化的研究

摘要

利用脱氧核糖核酸（DNA）和石墨烯修饰玻碳（GC）电极，为亚甲基蓝（MB）的捕集提供了一种新的有效平台。采用循环伏安法（CV）、电化学阻抗谱（EIS）和安培法研究了修饰电极（DNA/石墨烯/亚甲基蓝）的电化学和电分析性能。循环伏安结果表明，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）在还原电位时（0.1V vs.Ag/AgCl）所得到的电极具有良好的电催化活性。已经发现，DNA /石墨烯/MB修饰显著提高了对NADH氧化的有效电极响应。循环伏安法和旋转盘电极（RDE）实验表明，NADH氧化反应涉及两个电子，电催化速率常数（KOBs）为1.75 times; 106Ml～1L s-1。基于它的电化学传感器在pH值为7.0的0.1 mol L-1磷酸盐缓冲液中表现出较好的性能，优化了DNA、石墨烯、MB浓度及应用潜力等实验参数。在优化条件下，线性响应范围为10mu;mol Lminus;1到1.50 mmol Lminus;1，获得的灵敏度为12.75mu;ALmu;molminus;1。NADH的检测限和定量限分别为1.0 mu;mol Lminus;1和3.3 mu;mol Lminus;1。

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关键词：DNA 石墨烯 亚甲基蓝 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）

1. 引言

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）是一种重要的辅酶非蛋白，参与了300多种酶促反应[1]，在以DNA依赖性生物催化剂为基础的精细化工中也有应用。因此，NADH的电化学氧化成为众多传感器和酶基生物传感器发展的研究课题[1–12]。在这些研究中需要克服的一大挑战是，NADH与传统电极表面之间的直接电子转移需要相对较高的过电压[13,14]，解决这个问题的一个方法是使用化学修饰电极来降低反应活化能，提高电子转移速度。

将碳基纳米材料用于这类用途已经证明是一种很有前途的替代方法，这显然是因为这些材料具有许多不寻常和显著的物理化学性质[3–6,12]。在碳纳米管、富勒烯、石墨烯、纳米金刚石等碳基纳米材料中，石墨烯以其优异的导电性而受到广泛关注，主要来源于离域化的石墨烯pi;基面上下结合，表面积大，生产成本低[15,16]。由于这些优异的物理和化学性质，石墨烯已经成为电子器件[17]和电化学传感器[15,16]发展的有趣的替代品。与玻璃碳、石墨甚至碳纳米管传感器相比，石墨烯的电化学传感器具有更好的性能，主要是由于与其他碳材料相比，石墨烯纳米片上更容易暴露出类似sp2的平面和边缘缺陷[15,18,19]。

然而，许多已知形式的石墨烯材料在最常见的溶剂中不易分散或溶解。这种局限性阻碍了石墨烯在分子水平上的化学研究及其传感器和生物传感器的应用。石墨烯片具有高比表面积，除非彼此很好地分离，否则很容易形成不可逆的团聚，甚至通过范德华相互作用重新形成石墨[20-23]。

解决这一问题的一个已知的办法是结合适当的实验条件使用分散剂，如聚合物、生物聚合物或表面活性剂。在众多的生物分子中，脱氧核糖核酸（DNA）除了具有非常有趣的双螺旋结构外，还具有良好的生物相容性和可再生性，是一种很有吸引力的功能材料生物大分子，这保证了在其他分子和聚合物中难以检测的一系列独特性质[24]。

脱氧核糖核酸（DNA）作为一种重要的生物大分子，近年来备受关注。双螺旋DNA中的碱基对可以为电化学传感器的制备提供有效的平台[25]。许多吩恶嗪和吩噻嗪可以插入到DNA双链中，同时保持其对NADH氧化的催化活性[26，27 ]。DNA结合物已经被开发出来，为各种研究提供独特的功能，例如设计DNA杂交传感器和评估光诱导DNA损伤[28]。此外，由其他物种与DNA结合形成的杂化材料被证明是一种生产纳米结构材料的有效方法，这种材料能够对特定信号的特定刺激作出反应[28]。文献中已知碳材料可以与DNA分子自我组织[29]，基于理论预测[30]和实验证实[31]，由此得到的DNA/碳复合材料可以用作新的电子器件。由于DNA溶液可以糊化，混合后的DNA/石墨烯层在电极表面保持稳定，可作为多种电极材料上固定多种电催化剂的载体。亚甲基蓝（MB）是一种著名的氧化还原指示剂，由于其电子介导特性以及在低电位下对NADH氧化的电催化特性，在分析化学中是一种著名的氧化还原指示剂。然而，这种低分子量的可溶性介质会从电极中滤出，从而导致信号的显著丢失，影响传感器的稳定性。为了克服这些缺点，我们开发了由DNA和石墨烯组成的有机-无机纳米复合材料来固定MB。从这个意义上讲，这项工作为低电位下用DNA/石墨烯/MB修饰的玻碳电极检测NADH提供了一个新的平台。MB在DNA/石墨烯上的高效固定化是获得稳定、灵敏体系的关键。该传感器的优良特性可能与石墨烯的高导电性、大比表面积和大体积以及DNA固定MB的能力有关。

2. 实验部分

2.1. 试剂和溶液

所有使用的化学药品都是分析级的。石墨粉、NADH、双链DNA（ds-DNA）（Ⅰ型高度聚合，来自小牛胸腺）和亚甲基蓝（MB）从美国圣路易斯的Sigma获得，磷酸二钠和单钠（Na2HPO4和NaH2PO4）和Na2H2EDTA·2H2O从巴西圣保罗的Synth获得。每天用去离子水适当稀释储备溶液制备工作标准溶液。所有溶液均用在Milli-Q微孔系统中纯化的水制备，缓冲溶液的实际pH值用Corning pH/离子分析仪350模型测定。以0.1 mol L-1H3PO4-NaH2PO4为原料制备磷酸盐缓冲溶液（0.1 mol L-1），用0.1 mol L-1H3PO4或2.0 mol L-1NaOH调节pH值。

    1. 氧化石墨（GO）和DNA /石墨烯

GO是由石墨粉（Bay carbon，SP-1）[32-34]经悍马和奥夫曼法的改性而制备的[32–34]。在典型的反应中，0.5g石墨、0.5g纳米3和23ml硫酸在冰浴中搅拌在一起。接着，缓慢地添加3g KMnO4。所有化学品均从Sigma-Aldrich购买，并按收到时使用。混合后，将溶液转移至35plusmn;5°C水浴中，搅拌约1小时，形成厚浆。接着，加入40毫升水，将溶液搅拌30分钟，同时将温度升高至90plusmn;5℃。最后，加入100毫升水，然后缓慢加入3毫升H2O2（30%），使溶液颜色从深棕色变为黄色。然后过滤温水并用100毫升水冲洗。然后通过机械搅拌将滤饼分散在水中。以1000转/分低速离心2分钟。重复该过程，直到从沉淀中去除所有可见颗粒（约3-5次）。然后上清液在8000转/分的转速下再进行两次高速离心15分钟，以去除小碎片和水溶性副产物。最后的沉淀物用蒸馏水洗涤，并风干过夜以获得GO。

单链DNA/石墨烯纳米复合材料（DNA/石墨烯）是根据先前报道的方法，经过轻微的修饰合成的[33–36]。简单地说，首先将ds-DNA水溶液在95℃下加热2小时，以获得ss-DNA水溶液。将GO分散在水中，将混合物超声处理3h，得到均匀的黄棕色分散体。然后将GO分散液与ss-DNA水溶液混合，并将所得混合物搅拌1h。随后将联氨（85 wt%）添加到混合物中。然后将混合物在100℃下加热回流5小时，制备DNA/石墨烯纳米复合物。冷却至室温后，将所得材料离心并用蒸馏水洗涤三次，以去除多余的联氨和ss-DNA。制备了DNA/石墨烯纳米复合材料。

    1. 传感器结构

在修饰电极之前，对0.196 cm2面积的玻碳电极表面进行抛光，然后用超声波清洗以去除任何粘合剂。在清洗电极后，通过超声波处理混合MB和DNA /石墨烯复合分散体制备悬浮液。然后，将该悬浮液的20mu;L直接置于玻碳电极表面，并在80℃干燥10分钟，以在GC电极表面形成DNA/石墨烯/MB复合物。在所有的研究中都使用了同样的卷。10分钟后，用蒸馏水彻底冲洗修饰电极。

    1. 电化学和微观测量

电化学测量采用Eco chemie（乌得勒支，荷兰）公司的Autolab PGSTAT 128N恒电位仪/恒电流器，并用GPES 4.9软件与PC微机耦合进行。所有电化学测量均采用三电极电化学电池。工作电极为玻璃碳，安装在Teflonreg;中。计数电极和参比电极分别为铂电极和Ag/AgCl（sat），用鼓泡氮的方法除去溶液中的氧。

电化学阻抗谱已广泛用于表征表面修饰电极的界面性质。典型的阻抗谱（以奈奎斯特图的形式呈现）包括与电子转移限制过程相对应的高频半圆部分和表示扩散限制过程的低频段线性部分。阻抗谱中的半圆直径等于电子转移电阻Ret，它与电极表面氧化还原探针的电子转移动力学有关。[Fe（CN）6]4-/3-氧化还原偶合物在1.0 mmol L-1Fe（CN）64- Fe（CN）63-（1:1） 1 mol L-1KCl溶液中的形式电位下进行测量。采用基于单纯形优化和非线性最小二乘拟合分析的简单程序对所得EIS数据进行拟合。频率范围为0.530hz～100khz，正弦电位幅度为5mv。通过对奈奎斯特图上的半圆部分进行非线性回归分析，得到了回归值(Zim vs.Zre)。

所有的SECM测量在室温下用CHI 920C显微镜（CH仪器）在四电极结构下进行，使用分辨率为8纳米、行程为50毫米的步进电机定位器和XYZ压电块来定位针尖。所用的电化学电池是在直径为10毫米的聚四氟乙烯中制成的。SECM尖端是直径为5的Pt超微电极（UMEs）mu;m和RGsim;5（RG是中空玻璃半径RG与a的比值，因此RG=RG/a）。以2mu; m s-1的速度将电极尖端向修饰电极表面移动记录接近曲线，当针尖保持恒定电位时，针尖处液相电化学探针的扩散限制电流。

3． 结果与讨论

3.1. DNA/石墨烯/MB修饰电极的电化学特性

在用DNA/石墨烯/MB（图1a）、DNA/MB（图1b）和石墨烯/MB（图1c）修饰电极后，以0.05v s -1的扫描速率在0.1mol L-1PBS（磷酸盐缓冲溶液）中在-0.6至0.0v的电位范围内进行循环。在图1a中，DNA/石墨烯/MB/GC电极为MB/MB 与DNA/石墨烯的氧化还原偶联提供了稳定的电化学响应。当仅用DNA和MB修饰电极时（图1b），修饰电极的电流比用DNA/石墨烯/MB修饰电极的电流小两倍时（图1a），也有稳定的响应。DNA/graphene/MB修饰电极的电化学性能的提高可能与石墨烯的优异的电性能、大的比表面积、表面原子对许多表面反应的极端敏感性以及DNA固定MB的能力有关。然而，当仅用石墨烯和MB修饰电极时（图1c），电极的电流不稳定，比用DNA、石墨烯和MB修饰电极的响应低3倍（图1a）。这一结果表明，当DNA用作在石墨烯上捕获MB的平台时，MB的固定化效果更好。图1d为不同浓度下NADH氧化的安培曲线。根据此图，用DNA/石墨烯/MB/GC电极检测NADH具有较好的灵敏度。这种行为可归因于亚甲基蓝和石墨烯在DNA上的良好固定化。

图2a显示了该修饰电极在不同电位扫描速率下的PBS (pH 7.0)循环伏安图。从图中可以看出，循环伏安图在正向扫描时呈现阳极峰，与MB的氧化有关，而在反向扫描时呈现阴极峰，与MB 的还原有关。在图2b所示的0.2 V sminus;1范围内，MB/MB 对的峰值电流与扫描速率成正比。此外，在扫描速率低于0.2 V sminus;1时，形式电位几乎与电位扫描速率无关，这表明电荷转移动力学较高。

当扫描速度高于0.2 V sminus;1时，峰值电流成为与扫描速率的平方根成正比(图2 c)表明扩散控制的过程可以限制相关的反离子的扩散复合电极保持电中性。形式电位E0lsquo;约为- 0.266 V，与扫描速率在0.125到0.5 V s - 1之间的潜在扫描速率无关。形式电位(E0lsquo;)由公式[38]得到:

E0m=1/2(Epa Epc) (1)

通过循环伏安图的阳极峰下面积(100 mV/s)计算电活性物质的

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