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使用实时PCR检测城市污水中临床相关的抗生素抗性基因

Holger Volkmann, Thomas Schwartz*, Petra Bischoff, Silke Kirchen, Ursula Obst

摘要

开发了实时PCR测定法，用于可定量检测肠球菌的抗生素抗性基因vanA，肠杆菌科ampC和不同城市废水样品中的葡萄球菌mecA。构建并优化这些抗性基因的引物和探针设计，以用于标准化TaqMan PCR测定。使用参考菌株，定义测定的线性测量范围并覆盖5至7个指数值的浓度范围。从城市废水中培养耐万古霉素肠球菌（VRE）和耐h-内酰胺的肠杆菌科的废水分离物，以验证引物 - 探针系统的特异性和灵敏度。另外，对甲氧西林（MRSA）具有抗性的葡萄球菌临床菌株证实了mecA特异性检测系统的适用性。从五种不同的废水处理植物中提取总DNA，并用于直接TaqMan PCR检测抗性基因而无需事先培养。在城市污水中，21％的样品中检测到抗性基因vanA，而78％的样品中检测到ampC。在城市废水中没有发现基因mecA，而是在两个临床废水样本中。

关键词：底漆和探针设计;抗生素抗性基因;废水;实时PCR

1.介绍

抗生素抗性细菌的出现在传染病的治疗方面 具有很大的医学意义。由于抗生素的广泛应用， 已经观察到抗性细菌的增加（Aarestrup，1995; Feuerpfeil等，1999).这些细菌可以从住院和非住院医院接受抗生素治疗的患者中直接释放到废水系统当中。

此外，抗生素剂从各种其他人为来源进入环境（Aarestrup, 1995年; Witte,1997年 ;Halling-Sorensen 等 ，1998;Sengelov等，2002）。除了将它们用作人类和兽医治疗剂以及用于水产养殖中的预防目的之外，还在密集的畜牧育种中使用其他生物活性特性，例如促进生长。因此，在土壤，废水和地表水中可以发现痕量的抗生素（Hartig 等，1999; Hirsch等，1999）.即使高度稀释的抗生素也可能抑制敏感细菌的生长，从而传递环境隔室中的抗性细菌抗生素的持久性（Al Ahmad等，1999）。

由于调节连锁和抗性基因转录的诱导，抗生素 可能影响基因转移功能和其他功能基因的表达（Riedl等，2000).由于基因可能在分类障碍中水平转移，因此介导抗生素抗性的基因可能会扩散到原始宿主的栖息地之外（Barkay等， 1995; Moore和Lind- 说，2001）。为了防止与抗生素抗性细菌直接接触，需要监测它们的传播途径并评估环境区室的抗生素抗性状态。传统的抗生素耐药性检测通过表型鉴定进行，并根据NCCLS定义的最小抑制浓度（MIC）进行耗时的菌株培养（Ano，2003）。然而，基因型鉴定更快速，更准确，并且允许跟踪基于遗传的抗性。此外，它能够检测有活力但不可培养的微生物中的抗性决定簇。除了用于序列特异性分子生物学方法的成熟PCR技术（Schwartz 等，2003），实时PCR是一种量化抗性介导基因的工具。它具有高灵敏度的优点。为了获得临床相关抗生素抗性细菌的频率的概述，已经选择了三个确定相关医院病原体抗性的基因用于该研究。使用参考菌株和环境样品开发并测试了用于分类群特异性抗性基因检测的引物 - 探针设计。

由于发现细菌耐药性的发生频率迅速增加， 因此糖肽万古霉素是用于治疗革兰氏阳性抗性病原体感染的重要抗生素。然而，耐万古霉素肠球菌（VRE）发生在肉中（Lemcke和Buuml;lte， Pavia等，2000）和不同的环境隔室，如鸡粪和废水（Harwood等，2001），甚至在地表水样品中检测到（Schwartz等，2003）.vanA基因是肠球菌的主要耐药因子。它编码改变细胞壁特性所必需的连接酶，并随后降低万古霉素的亲和力。肠球菌携带vanA基因反映了对糖肽类抗生素的耐药状态。肠杆菌ampC是一种染色体抗性基因，用于合成h-内酰胺酶，能够水解青霉素G，ceftacidim 以及其他超光谱头孢菌素。（Bush et al. 1995; Pfeifle等，2000）。具有ampC抗性基因的阴沟肠杆菌表明粪便污染，并被选作临床和废水相关的肠杆菌科的代表。葡萄球菌是机会性细菌和医院感染的常见分离株，可能在患者中传播（ Hiramatsu 等， 2002）.重症监护中几乎50％的感染可归因于金黄色葡萄球菌或凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）（斯宾塞，1996年）。 自1990年以来，携带对甲氧西林耐药性必不可少的mecA基因的金黄色葡萄球菌（ MRSA ）和 CNS 的发生显着增加（Kresken等， 1999).MRSA多重耐药的感染特别严重，因为抗生素治疗受到很大限制。对于携带这些抗生素的抗生素细菌已经开发了基于TaqMan的检测方法。为了评估 它们的特异性，灵敏度和适用性，在各种类型 的处理后使用复杂的环境样品对它们进行测试： 使用来自临床和城市废水样品的参考菌株，分 离物，富集培养物和总DNA。随后，评估了抗生 素抗性细菌的排放所带来的潜在风险。

2.材料和方法

2.1参考菌株

屎肠球菌B7641 vanAr （Patel等， 1997）作为vanA基因的参考菌株。菌株金黄色葡萄球菌A1 mecAr （从患者分离的临床MRSA）和从临床废水样品中分离的阴沟肠杆菌A10 ampCr ， 并测试其对青霉素G具有抗性（16 Ag ml- 1）和头孢他啶（32 Ag ml- 1）进行分类学鉴定。根据以所属述方法通过测序验证它们的抗性基因E. faecium DSM 20477 ， Escherichia coli DSM 1103和S.aureus ssp。金黄色葡萄球菌DSM 20231作为抗生素敏感对照（无扩增，阴性对照）。临床分离的葡萄球菌S1 - S4由海德堡大学友情提供。

2.2采样点和样品制备

收集来自流入物，活性污泥和具有不同集水区以及临床废水的城市污水处理厂的流出物的水样（500ml）用于培养实验和DNA提取。通过在 叠 氮 化 物 - 葡 萄 糖 肉 汤（ Oxoid ， Basingstoke，England）中37℃培养24小时来富集肠球菌。根据NCCLS，通过选择含有浓度为32 Ag ml- 1 的万古霉素的卡那霉素天冬酰胺琼脂（Merck，Darmstadt，Germany）获得耐万古霉素的分离物。由于废水中肠杆菌科的丰度很高， 通过在Chromocult琼脂（Merck）上培养获得分离物，通过添加头孢他啶（32 Ag ml- 1而不事先富集来选择抗生素抗性。对于平板计数实验，将悬浮细胞和屎肠球菌的参考菌株悬浮，在PBS缓冲液（137mM NaCl， 7.25mM Na2HPO4，0.2mM KH2PO4中连续稀释。 2.7 mM KCl，pH 7.4），通过倾注平板法在R2A琼脂（Difco，Detroit， USA）或Slanetz-Bartley琼脂（Merck）上培养以进行定量。

2.3 引物 - 探针设计和实时PCR（TaqMan）

抗性基因vanA，ampC和mecA的序列获自NCBI 数据条目， 登录号为X56895 （屎肠球菌质粒pIP816 vanA基因）， AF411145（ 阴沟肠杆菌ampC基因）和E09771（金黄色葡萄球菌mecA）。基 因 ） 。 使 用 软 件 工 具 Primer Express（Applied Biosystems），选择引物和探针用于标准化TaqMan扩增方案。所有引物和FAM标记的荧光探针均由Applera Darmstadt，Germany 商业合成。使用序列比对确定引物和探针特异性BLAST和NCBI数据条目。测试它们与各自敏感菌株的交叉反应。通过实时PCR进行的扩增用ABI 7000 或 7700 序 列 检 测 系 统 （ Applied Biosystems）进行。溶解在10-Al体积中的总DNA的10-100ng ml- 1样品在50-Al反应体积中扩增每种引物300nM，200nM FAM / TAMRA标记的探针， 25 Al 2 TaqMaxn Universal Master Mix（Applied Biosystems）和7 Al H2O，具有标准TaqMan温度曲线（在50℃下2分钟，10分钟） 在95℃下进行40个循环，在95℃下15秒，在60℃ 下1分钟）。

通过连续稀释的参考菌株的三次扩增运行测试开发的引物 - 探针系统。获得的Ct 值用于产生校准曲线，并通过与平板计数实验的相关性来量化。为了评估由废水DNA提取物的杂质引起的可能的PCR抑制效应，进行TaqMan PCR测定，用相同体积的废水样品提取物替换标准混合物的水（最终含量为0.4 Ag的基因组DNA，并且已知没有mecA目标序列（施瓦茨等人， 2003).从参考菌株金黄色葡萄球菌A1 mecA 中提取的逐步稀释的DNA用作实时PCR系统mecA1的靶标。为了避免DNA过载引起的PCR抑制，PCR测定中DNA的总量不超过1 Ag。平行地，在不添加废水提取物的情况下进行用于检测mecA的标准测定。

2.4分类和抗性基因鉴定的测序

通过16S rDNA的部分测序在分类学上鉴定菌株。通用引物27F（5V-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3）和517r (5-attacgcgcgtgtgggggg-3)（Muyzer等a。，1993，Kilb等，1998）用于产生位置为8-534的526-bp扩增子，指的是大肠杆菌的16S rDNA 。（Brosius 等，1981）。在95℃ 下激活HotStar Taq聚合酶（Qiagen Hilden）15分钟并且最终延伸周期为50分钟时，PCR分析具有35个循环，94℃，30秒，49℃，30秒和72℃，1分钟。72 jC for 7min应用了。27F引物也用于测序反应。为了序列验证抗性基因vanA ，使用引物vanA1（5V- TCTGCAATA-GAGATAGCCGC-3 ）V和vanA2 （5-GGAGTAGC-）扩增特异性PCR产物。TATCCCAGCATT-3）如Klein所属等。.随后，引物vanA1 用作测序引物。用ampC-For（5V- TTCTATCAA-MACTGGCARCC-3）和 ampC-Rev （5-CCYGTTT-）扩增抗性基因ampC根据Schwartz等）。抵抗基因mecA与mecA1（5- AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC-3）和 mecA2 （ 5- AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC-3V）（Murakami等，1991）使用各自的前锋 用于测序的引物。使用GeneAmp PCR System 9700 ，Applied Biosystems，Houston，USA合成所有扩增物。

使用BigDye进行基于Sanger反应的PCR产物的测序（Sambrook等，2001）终结者周期 测序就绪反应化学（Applied Biosystems）。测序反应在96℃下变性步骤开始5分钟，然后在55℃ 下退火25个循环5秒，并在60℃下延伸反应终止1 分钟（ GeneAmp PCR System 9700 ， Applied Biosystems ）ABI Prism 310 遗传分析仪 （Applied Biosystems）用于片段分离和序列分析。

利用获得的DNA序列，使用NCBI数据库软件http://www.ncbi.nlm.nih.gov 进行 BLAST DNA同源性搜索。

3结果

3.1抗性细菌分离物的培养和鉴定

对五个城市污水处理厂进行了抗生素抗性细 菌的检测。在从所有废水样品中特异性富集后， 分离出耐万古霉素肠球菌（VRE）和耐h-内酰胺 的肠杆菌科细菌。

基于16S rDNA的测序分析证实了这些结果。肠球菌菌株EF1-EF4与屎肠球菌显示99-100％的同源性， 分离的肠杆菌科EB4 ， EB86 ， EB101 和EB102与98-100％同源。阴沟肠杆菌。对h-内酰胺抗性肠杆菌科的扩展分 析 表 明 ， ampC 系 统 也 与 弗 氏 水 滑 霉（Citrobacter freudii）和大肠杆菌（E.coli） 的ampC基因匹配。之前的学习（Schwartz等，2003）在该研究的框架内进行的培养实验表明，没有从城市污水样品中分离出葡萄球菌。因此，从海德堡大学获得的临床分离株S1-S4，来自患者的耐甲氧西林葡萄球菌被用于实时PCR实验。它们与金黄色葡萄球菌的分类学特征被证实与NCBI数据条目的同源性为99％。用上述抗性细菌进行用于扩增抗性基因vanA， ampC和mecA的特异性PCR实验。PCR结果和随后 的测序均证明肠球菌的耐药性是由vanA基因介 导的，阴沟肠杆菌，弗氏乳杆菌和大肠杆菌的h-内酰胺抗性是由ampC基因决定的，甲氧西林耐药性是葡萄球菌基于mecA抗性基因的存在。所有抗性决定簇与NCBI数据条目显示99-100％ 的同源性。

3.2 引物和探针设计和反应的特异性

根据优化的TaqMan PCR（Primer Express软件，Applied Biosystems）的参数，设计引物和探针用于检测vanA，ampC和mecA（表格1）. 肠球菌vanA 基因与引物vanA3FP / RP 和探针vanA3FAM的示例性TaqMan PCR扩增图显示于图1。 通过扩增过程产生的信号强度以线性标度绘制。如图中所示，选择高于背景的阈值用于荧光信号的显着增加。

表格1用于特异性检测抗性基因vanA，ampC和mecA的引物和荧光探针

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