ε-己内酯-己内酯合成动力学研究：酶级联反应的改进外文翻译资料

 2022-07-21 14:33:37

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ε-己内酯-己内酯合成动力学研究：酶级联反应的改进

摘要

一种模拟和预测与环己酮m-醇脱氢酶(ε-己内酯)偶联的线性三步酶级联反应的计算方法，单加氧酶(CHMO)和脂肪酶用于ECL的后续水解为6-羟基己酸(6-HHA)，以这个体系为基础建立了一个动力学模型，其预测精度为37%环己醇(CHL)，而ECL则为90%，最终产物6-HHAgt;99%。由于CHL对CHMO有严重的抑制作用，间歇合成的效率比进料分批法要低，在分批进料的合成过程中，100 mm CHL的全转化率提高了28%，分析收率为98%，而间歇合成的转化率为49%。脂肪酶催化ECL水解制6-H HA绕过ECL对CHMO的抑制作用，在不加脂肪酶的情况下，6-HHA的产物浓度比ECL高24%。

关键字

ε-己内酯，酶级联，氧化还原酶，反应工程，计算机模拟，

介绍

目前的工业合成ε-己内酯（ECL）是以化学过氧羧酸（Bayer-Viiger-1899）为氧化剂进行的。（(Brink等，2004年；Krow ，2004年)。然而，UCC(联合碳化物公司)工艺对环己酮氧化的选择性已经达到了约90%，并且还存在着进一步提高的可能(Weissermel和Arpe 2003)。与化学氧化相比，Baeyer-Villiger单加氧酶(Bvmo)生物催化合成ECL不需要有害氧化剂，因此是一种选择性高并且安全的方法(Donoghue等，1976年)。然而，这种酶较差的稳定性是制约其工业应用的关键，不同的研究小组都强调了这一点：设计更稳定的变体或新酶(Mihovilovic， 2012年；Opperman和Reetz，2010年；Romero等，2016年；Schmidt，2015年，Bvan Beek等，2014年)。由于生物催化法需要烟酰胺辅助因子，所以，全细胞硒一直是被高度关注(Alphand等人，2003年；Alphand和Wohlgiuth ，2010年；Baldwin等，2008年；Fink等，2011年；Law等，2006年)在提供碳源再生辅助性因素的条件下。当使用分离的bvos时，该反应需要与适当的辅助因子回收系统耦合，例如，使用具有相同辅助因子依赖性的醇脱氢酶(Adhs)。 以并行方式再生辅助性因子并氧化牺牲底物(Seelbach等，1996；wong等，2003年)自给线性级联 ADH(WECKBecker和Hummel，2006年)和环己酮单加氧酶(CHMO)(Donoghue等，1976年)用于合成ECL使得生物催化途径非常有效，因为仅有单一的底物末端的最终产品（马林等，2013年；scherkus等，2016年，施密特等，2015年；施密特等，2015年； Staudt等；2013年）。由于CHMO对高浓度底物和产物的敏感性及其在工艺条件下的不稳定性，反应工程（BISELLI等，2002）对这一酶法的整体生产力有巨大的影响(克拉格勒等，1996年；Liese和克拉格尔，2013年)。最近我们报道了上面提到的adh-chmo线性级联，它扩展了在以水为介质的体系中，脂肪酶催化ECL水解为6HHA（S切尔库斯等，2016）

其中，我们证明CHMO对CHL的抑制可通过加入该化合物的补料分批加入来克服。另一方面，通过使用从南极念珠菌(CALB)中提取得到的脂肪酶B，可以避免由ECL抑制CHMO立即水解ECL到6-HHA。

在本研究中，我们重点研究了这三个反应步骤背后的动力学，并说明了它们是如何相互关联的。用计算机程序进行了详细的动力学分析。 ACH对级联反应过程进行模拟和预测，为整个反应系统的优化提供理论依据。

实验部分

方法如我们之前的出版物所述(Scherkus等，2016年)。

材料

环己酮 (ACS试剂, gt; 99%), MgCl2 (gt; 98.5%), NADP 二钠盐(gt; 97%), NADPH 四钠盐(gt; 97%), 氨苄青霉素(99%),异丙基硫代半乳糖苷(gt; 99%). 从干酪素中提取(微量颗粒)、LB-培养基(卢里亚/米勒)、甘油(罗蒂普兰，ge;99.5%)、胰蛋白胨/蛋白胨是从卡尔·罗斯(德国卡尔斯鲁厄)购买的。ε-己内酯单体(99%)为从Acros Organics(比利时Geel)购买并且即买即用。环己醇(ReagentPlus，99%)是从Sigma-Aldrich(美国圣路易斯，MO）购买的并且经过减压蒸馏以除去环己酮杂质。大肠杆菌BL 21(DE3)活性细胞是从新英格兰生物(Ipswich，MA，USA)购买的。

细菌菌株和质粒

含钙乙酰不动杆菌(C376L/M400I)环己酮单加氧酶突变体(CHMO)基因的转化(Schmidt等，2015年)或乙醇醛 用热休克法在大肠杆菌BL 21(DE3)中进行大肠杆菌BL 21(DE3)表达，在LB-培养基、LB琼脂平板(1.5%琼脂)或B培养基中进行细胞培养。 Roth(Tb，12g/L胰蛋白胨，24g/L酵母膏，5g/L甘油，17 mm KH2PO4，72 mm K2HPO4)蛋白表达，外加氨苄西林(100mu;g/mL)，用于ADH或卡那霉素(50)的高表达或CHMO的过度表达。

酶和粗提物的制备

在2-L隔板摇瓶中制备400 mL TB培养基，并接种4 mL隔夜培养。细胞在37°C下培养至OD6000.8~1.0，然后在振荡下过度表达。 IPTG诱导，最终浓度为0.1mm。细胞在室温下进一步生长。(19-25°C)20-24小时，然后用离心法收集细胞。 用磷酸钠缓冲液(100 mm，50 mm NaCl，pH 7.2)一次，然后重新悬浮。相同磷酸盐缓冲液15 mL。接下来，细胞被超声波破坏(Son脉冲HD 2070和声纳，Ke 76型，Bandelin电子有限公司，公斤，柏林，德国)在冰中进行三次这种操作(5分钟，50%的脉冲时间和70%的功率)。细胞碎片经离心(45 min，~69，000 g)和 将无细胞溶质转移到新的试管中，并将其保存在4℃。

从南极念珠菌(Calb)中获得的的脂肪酶B共价固定在其上的亲水载体(Fermase Calb 10000-K15，9200 plu/g)是从Fermenta生物技术有限公司购买的。(印度马哈拉施特拉邦)。

分析技术

用Uvikon XL分光光度法测定了ADH和CHMO在动力学研究中的活度，用Uvikon XL分光光度计测定了ADH和CHMO的活性。 在25℃条件下，在1 mL小杯中监测NaDPH在340 nm处的形成或消耗，以磷酸钠缓冲液(100 mm，pH 8)为反应介质，温度在在25~27℃。

NADP和NADPH在磷酸盐缓冲液(100 mm，pH 8)中稀释至接近浓度。20-25毫米每次解冻和再用时，都会确定NADPH的最终浓度。 在990升缓冲液中稀释10升NADPH原浆，并进行适当的混合。用摩尔消光系数计算浓度NADPH=6.22mm-1cm-1。

NADP 浓度通过50micro;L葡萄糖脱氢酶（约5mg冻干粉/mL磷酸盐缓冲液）、10micro;L葡萄糖（1MAQ）将所有NADP 转化为NADPH。 10 L NADP原液(20~25 mm)在1mL磷酸盐缓冲液中。观察1 min，直到吸光度值不再变化为止，这时一般人们认为 NADP转化为NADPH。

每次新鲜制备1%（v/v）水溶液（95mm）时，将环己醇和环己酮稀释物测量酶活性，将10micro;L在1mL蒸馏水中稀释10micro;L，并适当混合。

REFE 用50 L预稀释无细胞提取物、0.01%(v/v)环己酮(0.95 mm)和0.2mm NADPH在1mL磷酸钠缓冲液(100 mm，pH 8)中测定CHMO的活性。用50L预测法测定ADH的参比活性。

稀释粗提液，0.01%(v/v)环己醇和0.6mm NADP，总体积为1mL磷酸钠缓冲液(100 mm，pH 8)。在40 mL磷酸钠缓冲液(10 mm，pH 8)和10~20 mg固定化钙溶液中水解0.946 mmol(100 L)，测定钙的活性。反应用自动滴定法监测。 用NaOH(1M)保持pH值。

用Origin8.5.1G软件计算了滴定曲线上的拟一级反应常数，用以下方程：n=n∙(1minus;𝑒minus;𝑘lsquo;et) En是时间t；n，总摩尔数；E，Calb的质量浓度保持不变(gL-1)；𝑘lsquo;，速率常数(L-1min-1)。提供的实验数据 基本信息(图SI1)。

用气相色谱法(AgilentTechnologies 7890B)对环己醇、环己酮和ε-己内酯进行了气相色谱分析，气相色谱中配置了cp-Chirasil-dex CB(Agilent)，25 mx。 0.25mmtimes;0.25m柱烘箱温度分布从150℃开始，持续3 min，温度梯度为167℃(20℃/分钟)，190℃(30℃/min)，维持1.4 min。用萃取法分离出20种分析物，水样或标准品转入1毫升管内，并在其中放置10微升苯乙酮(DMSO为23.8 mg/mL)为内标，300 微升氯仿为内标。在旋涡和相分离器作用下操作1分钟后 通过离心，将氯仿相200微升转移到带有微入口的GC玻璃瓶中。保留时间见补充资料(图SI2和Si3)。

生物催化与实验装置

在温度调节的圆锥形75 mL容器中进行间歇合成，并用磁搅拌器搅拌。反应液通过硅胶管内部循环(5米），使用管式泵(IPC，Ismatec，Wertheim，德国)。硅氧烷管被装进氧气充气玻璃瓶中。

通过膜曝气提供氧气(图Si4)。反应液中的溶解氧浓度是在反应液进入膜前直接在流过池中监测的。 Ne模块和在线测量的光学氧探针(Fibox 3液晶显示跟踪，预感精密传感，雷根斯堡，德国).用自动滴定法(Metrohm 848，Deutsche METROHM)维持pH（GMH公司，菲尔德施塔特，德国）。

计算机模似

在MATLAB 2015软件(MathWorks GmbH，Natick，MA，USA)中进行了仿真。

结果与讨论

反应工程和计算机辅助模拟需要对反应的动力学和热力学有详细的了解。在这里，我们集中讨论线性顺序反应的动力学。因此，对所有该反应中的步骤的动力学（图1）分别进行了研究。由于ADH催化的第一步是可逆反应，CHL氧化到CHN和相应的逆反应。 考虑了相应的逆反应速度的降低。而由CHMO催化的第二步氧化是不可逆的。这两种酶都需要在级联过程中以酶偶联的方式再生一种烟酰胺辅助因子。 以所谓的“闭环”方式进行反应。为了应用双底物米氏-Menten动力学，那么确定每个步骤的初始反应速率的方法为先增长其中一个反应物A的浓度，同时另一个反应物B的浓度保持不变。再反过来，增长反应物B的浓度，同时保持另一个反应物A的浓度保持不变。

由于所有的测量都是用含有所需的过表达酶的细菌无细胞粗提取物进行的，所以不能确定特定的酶浓度。因此，特定的动力学常数amax结合方程1中所示的Vmax和酶浓度（[E]），被引进并用于表示最大体积活性。

通过拟合相应的Michaelis-Menten双底物氧化动力学方程(方程2)和被ADH催化的还原反应动力学方程(方程3)，得到了其中的Amax，Km和Ki值(补充资料，图SI5)。同样地，考虑到CHL、ECL和底物剩余CHN的抑制作用，CHMO催化的氧化反应也采用了方程4 (补充资料，图S6)。表一概述了ADH和CHMO的动力学常数。

通过模拟不同起始浓度的CHL、NADP和NADP的间歇合成，证实了初始速率测量确定的动力学常数对ADH的意义。 与1mL比例尺下的实验结果进行比较，在340 nm的分光光度计上对反应过程进行监测(数据未显示)。对于微调，氧化和减少的ADH的amax值也经过不断的对实验数据和计算数据进行了人工调整，得到了优化的拟合值。因此，通过改变amax来调整整体活动，而平衡时的浓度的调整则是通过调整amaxred和amaxox的比例来完成的。由平衡浓度可导出0.034的平衡常数，揭示出一个有利于CHL的热力学平衡。

在CHMO催化的第二步氧化反应中，由Calb催化的ECL水解生成6-HHA作为最终产物。由于水是过量的，所以完全的水解是可能的。 利用方程5和方程6，假设了一个考虑Calb浓度的伪一级反应和观察到的(补充信息)和一个拟一级反应。

这种假设的原因仅仅是因为在反应过程中，Calb浓度保持不变。KECL的速率常数被设定为为0.004 L g-1 min-1根据脂肪酶催化水解的理论。此外，在碱性条件下，ECL易发生非催化水解。因此，确定了其非催化水解降解速率常数。

ADH和CHMO对间歇合成的初步实验表明，在完全转化后，质量平衡未被停止。这一方面是由于未催化水解的ECL所致。 另一方面，由于CHL的损失(大约14%，图2，图Si4和SI7))很可能是通过气液界面或通过溶解于用于供氧的硅胶管(补充物)扩散而成的。因此，确定了CHL浓度耗尽的速率常数为。由于CHN是在当场形成的，所以它的浓度仍然很低，并且因为蒸发或者溶解而损失的CHN的量是可以忽略的。

基于各参与组分的质量平衡，建立了完全线性级联反应的动力学模型，并描述了反应体积(V)的变化。 微分方程7至12。

从20毫米CHL开始的ECL批量合成的实验数据和计算数据的比较如图2所示。在模拟过程中，给出了酶的最大总活性。

根据实验和计算数据的均方误差，对CHL和ECL的拟合度分别为91%和97%。这些结果证明了合成 ADH-CHMO线性级联的ECL可以用假设动力学模型来描述，实验结果与模拟结果吻合良好。

图2中CHL和ECL浓度的异常，几乎线性过程，而不是指数级的过程，反映了CHMO和ADH相对于变化的浓度的相反动力学。 用Km(ADH表示CHL)和Ki(CHMO表示CHL)值表示CHL的离子(表I)。并举例说明了在间歇合成过程中，CHM

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