Novozyme 435催化游离脂肪酸与辛醇酯化合成辛酯的动力学研究外文翻译资料

 2022-08-08 11:08

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Novozyme 435催化游离脂肪酸与辛醇酯化合成辛酯的动力学研究

摘要：辛基酯可以作为一类重要的生物润滑剂成分替代矿物油成分。本文研究了在无溶剂体系中，利用商品脂肪酶 Novozyme 435，研究了废食用油中游离脂肪酸(FFA)与辛醇的酯化反应。结果表明，在研究的浓度范围内，酯化反应遵循乒乓双重动力学，不受底物或产物的抑制。估计最大反应速率为0.041 mol L21 g21 h21。此外，通过测定 Novozyme 435的活性以及连续12次利用后 FFA 转化为酯的转化率，研究了 Novozyme 435在当前反应体系中的稳定性。Novozyme 435在7个反应周期内表现出几乎100% 的酶活性，此后逐渐下降(5%)。该研究评估的动力学参数将有助于设计用廉价生物质来源大规模生产辛酯的反应器。酶的可重用性数据可以通过减少昂贵的酶消耗成本进一步促进大规模生产。

关键词: 酯化反应，Novozyme 435，酶动力学，乒乓 bi bi，酶活性，游离脂肪酸

导言

酶是一类重要的生物分子，能够催化成千上万的化学反应。这些生物催化剂具有以下优点: (i)操作条件温和，(ii)能耗低，(iii)产品纯度高，(iii)环境友好。1,2脂肪酶是一类特殊的酶，能够水解甘油三酯中的酯键，释放脂肪酸和甘油，反向催化这些反应生成酯。虽然大多数脂肪酶仍以可溶性形式使用，但固定化脂肪酶正越来越多地被使用，其中酶被局部化在一个确定的空间区域(载体材料上)。固定化脂肪酶保证改善技术过程的经济性，确保酶的再利用不止一次，产品污染最小。

对于任何生化反应动力学的全面了解不仅对于理解反应机理是必要的，而且对于设计大规模工业用途的反应器也是必要的。多底物反应可分为两类: (i)序贯三元复合机理，即所有底物在催化前同时加入到酶中，并且存在复合酶底物中间体; (ii)非序贯乒乓或双重置换机理，即底物以强制的方式结合。

当涉及两个基体和两个产物时，称为乒乓双重动力学机制。在研究猪胰脂肪酶在不同有机溶剂中与油酸和乙醇的酯化反应时，Hazarika 等人报道了乙醇抑制的乒乓 bi-bi 模型。以南极念珠菌(Candida antarctica)固定化脂肪酶 Novozyme 435为原料，在叔丁基甲醚介质中，通过乙酰丙酸与正丁醇的酯化反应，合成了乙酰丙酸正丁酯。研究了皱纹假丝酵母(Candida rugosa)催化丁酸和油酸与正丁醇和油醇在正己烷中的酯化反应。他们报道了该体系遵循乒乓双双动力学，两种底物均具有竞争性抑制剂。Maury 等研究了来自 Burkholderia cepacia 的脂肪酶催化的酯化动力学，游离和包封。他们也报道了反应遵循来自两种底物的抑制的 Ping-pong bi-bi 动力学。另一方面，Basheer 等描述了在正己烷体系中，日本根霉脂肪酶催化月桂酸和十二醇酯化反应的乒乓反应动力学，没有抑制作用。N435(Novozyme 435)在丙酮11中使脂肪酸与葡萄糖发生酯化反应，9,10-二羟基硬脂酸在正己烷中使用 Rhizomucor meihei 脂肪酶与1- 辛醇发生酯化反应，在没有任何酶抑制的情况下也证明了这些反应的动力学。

虽然大多数报告的关于酶催化裂解的研究表明使用了有机介质，但这种工艺的商业化设置存在许多困难。大量使用有机溶剂不仅阻碍了该工艺的经济可行性(酶失活、产品回收费用高和能源消耗) ，而且其处置也对环境造成毒性威胁。因此，无溶剂反应作为一种经济可行和环境友好的替代品出现在有机介质中的反应。

生物润滑剂的合成越来越受到探索，目的是用替代植物油基生物润滑剂取代不可再生和不环境友好的石油基润滑剂。植物油可以通过酯交换反应、15次酯交换反应、16次环氧化反应、17次环氧化反应等化学反应形成生物润滑油组分。在这方面，作者已经建立了从废食用油中酶促合成辛酯作为潜在的生物润滑剂成分的方法。18了解到从廉价的废食用油中生产这些生物润滑剂成分具有很大的商业开发潜力，本研究在无溶剂介质中利用固定化脂肪酶 N435对来源于废食用油的游离脂肪酸(FFA)与辛醇之间的酯化反应动力学进行了广泛的研究。还描述了传质阻力对反应系统的影响。对这一特殊生化反应的动力学研究将使我们能够评估关键的动力学参数，这些参数反过来将有助于设计和放大用于大规模酶法合成生物润滑剂的反应器。此外，还通过测定其活性来研究生物催化剂在目前反应体系中的稳定性。关于这种系统中酶的可重用性的信息应有助于降低昂贵的生物催化剂的成本，同时进行大规模生产。

实验

材料：利用气相色谱仪(agilent6890，no. 05.05，配备 FID 检测器)对 FFA 的脂肪酸组成进行了分析，发现 FFA 主要由油酸、棕榈酸、亚油酸、硬脂酸及微量的肉豆蔻酸和芥酸组成。采用大孔阴离子树脂固定化南极念珠菌(Candida antarctic)脂肪酶，制备了 Novozyme 435催化剂。1- 辛醇(99% 纯度)获自 Merck。分析中使用的所有其他化学品都是分析级别的，并购自 Merck。

酶435的性质：

物理形态

球形不透明珠

平均粒径（厘米）

0.042

平均表面积

760000

孔隙率

0.43

平均孔径

230

曲折性

5.3

角色塑造生物催化剂的表征：进行不同的表征测试以估计 N435的物理性质(角色塑造)。数据已在表1中报告。平均粒径由英国 Malvern Instruments 的 Mastersizer 2000测量。通过标准 BET 仪器(Quantachrome make NOVA)测量催化剂的表面积和平均孔径。

酯化反应：N435催化 FFA 与辛醇的酯化反应在反应器中进行，这是继作者先前发表的工作之后进行的。18样品不时地被提取，以测定 FFA 在酸值方面的辛酯转化百分比。温度，酶量和搅拌速度分别保持在608C，FFA 的5 wt% 和400rpm。发现250rpm 带来可满足的酯转化，因此被选择用于所有合成反应。但是在确定反应的动力学时，搅拌器速度得到增强，以完全消除外部传质限制(稍后详细讨论)。除非另有说明，否则所有实验在上述操作条件下一式三份进行。

酶的可重用性：对 N435连续使用12个周期后的酶活性进行了测定，得到了最佳条件(温度5608c，酶用量55% FFA，辛醇与 FFA 的摩尔比52.5:1，搅拌速度5250rpm，时间53h)。在每次运行之前和之后测量酶活性。首先，用0.02 n KOH 滴定法测定酸醇混合物中游离脂肪酸的酸值，然后加入酶。最后，在3小时反应时间结束时测定 FFA 消耗量。所有酶活性测定一式三份进行。N435的相对活性定义为从每个周期获得的 FFA 含量与在第一个周期中达到的 FFA 含量的比率。FFA 含量测定的计算是在 Von der Haar 等人的工作之后完成的。

酶再生：在每个酯化周期后，通过过滤将生物催化剂从反应介质中仔细地分离出来。接下来，使用15ml 庚烷洗涤酶珠，并在408C 的烤箱中干燥1小时。回收的酶在干燥器中保存24小时，然后用于下一个周期。

动力学研究：通过研究每种底物浓度(FFA 和催化剂用量对酯化反应动力学的影响，研究了酯化反应动力学)

图 在间歇反应器中，作为搅拌速度函数的辛酯形成的初始速率

结果和讨论

质量传递行为：研究非均相催化反应的主要限制是在化学反应期间扩散传质阻力的可能侵入，这可能使系统不经济地缓慢。为了推断在考虑的实验条件下，N435酶催化 FFA 与正辛醇的酯化反应是否受动力学控制，确定扩散传质阻力的外部和内部是至关重要的。当使用固定化酶时，为了到达酶分子，反应物必须首先从大量液体扩散到催化剂颗粒的表面，穿过一层停滞的液体，然后进入其孔内，在那里酶被固定化。这样的外部膜层屏障中，通过提高间歇式反应器的搅拌速度可以减轻外部传质限制。

很明显，在350rpm 之后，反应速率没有显着变化。因此，对于批量动力学研究，400rpm 是标准化的，确保 FFA 与辛醇的绝对混合以及 N435珠在散装液体中的完全分散。因此外部传质阻力被认为可以忽略不计。

已知固定化酶微珠的内部传质阻力取决于微珠的大小、微粒的孔隙率和载体材料的极性等因素。

溶剂负载量(mol g21 s21) ，质量分数(qc)为催化剂的体积密度(g cm23) ，反相速率(Rp)为催化剂粒子的平均半径(cm) ，De 为催化剂孔内的有效扩散系数(cm2 s21) ，ca0为溶剂中 FFA 的浓度(mol L21)

其中2rA 为比反应速率，基于反应物体积(mol L21 s21) ，m 为反应相体积(l) ，w 为催化剂质量(g)。有效扩散系数(De，cm2 s21)是根据表1中的孔隙度(e)和弯曲度(s)确定的。

t (k)是绝对温度，l (g cm21 s21)是溶液的粘度，VFFA (cm3 mol21)是 FFA 的摩尔体积。DFFA2Oct 值为1.1431022cm2 s21，De 值为9.2531024cm2 s21。

随后，Weisz-Prater 参数估计为1.7231024。结果表明，内部传质阻力对整个反应动力学没有影响。因此，外部传质阻力和内部传质阻力对观察到的 FFA 酯化反应速率的影响可以忽略不计，是一个完全的动力学控制反应。

动力学建模

图2描述了当 FFA 浓度保持不变时，不同辛醇浓度对酯化反应速率的影响。类似地，图3显示了反应速率作为不同 FFA 水平的恒定辛醇浓度的函数。在这两种情况下，反应速率随着底物浓度的增加而增加。这些图(图2和图3)是酶动力学的特征，没有任何两种亚型的明显抑制。

图 在不同辛醇浓度下，酶促酯化反应速率随FFA含量的变化而变化

根据底物浓度随时间的初始曲线计算的反应速率用于构建 Lineweaver-Burk 或双倒数曲线(图4)。1/Vo 与不同固定辛醇浓度下 FFA 浓度的倒数作图，其中 Vo 表示初始反应速率(moll21g21h21)。结果表明，在研究的浓度范围内，N435与游离脂肪酸反应生成24n435，但没有明显的抑制作用。

图 在不同的FFA浓度下，酶促酯化反应速率随辛醇含量的变化而变化

图 Lineweaver-Burk对FFA和辛醇酶促酯化反应速率与游离脂肪酸浓度的双倒数图

其中 kmeth;FFA thorn; 和 kmeth;octthorn; 分别是 FFA 和辛醇的 Michaelis-Menten 常数，Vmax 是最大酯化速率，[ FFA ]和[辛醇]代表 FFA 和辛醇的初始浓度。图4的平行线的斜率与辛醇浓度无关。随后，释放一摩尔水作为形成酰基 -n435中间体(修饰酶)的第一产物。该中间体然后与辛醇反应产生相应的辛酯，使酶在末端游离(方案1)。对ffa和辛醇的km值表明，n435对两种底物具有相当的亲和力，因此在所研究的浓度范围内没有明显的酶抑制作用。在另一项月桂酸和十二醇的酯化反应中，作者还报道了棕榈酸脂肪酶对两种底物(kmla510.6mmoll21和kmdoh511.9mmoll21)的结合亲和力。10awang等12在研究棕榈基脂肪酶9,10-二羟基硬脂酸(dhsa)和1-辛醇的酯化反应动力学时，也发现了相似的固定化棕榈酸脂肪酶对两种底物的结合亲和力。他们报道dhsa和1-辛醇的km分别为1.3moll21和0.7moll21。但是，gofferje等人发现脂氧酶对甘油的亲和力比对油酸的亲和力(kmoh50.03moll21和kmcooh50.2moll21)高近7倍，因此该系统被酰基受体抑制。

结果表明: Km (FFA)51.08 mol L21，Km (Oct)52.07 mol L21，Vmax 50.041 mol L21 g21 h21。游离脂肪酸和正辛醇的 Km 值表明 N435对两种底物具有相当的亲和力，因此在研究的浓度范围内没有明显的酶抑制作用。在另一项月桂酸与十二醇酯化反应的研究中，作者还报道了日本血吸虫脂肪酶与两种底物(KmLA510.6 mmol L21和 KmDDOH 511.9 mmol L21)的相似结合亲和力. 10 Awang 等[12]在研究棕榈基9,10-二羟基硬脂酸(DHSA)和1- 辛醇酯化反应动力学时，也报道了美黑血吸虫固定化脂肪酶与两种底物的相似结合亲和力。他们报道 DHSA 和1- 辛醇的 Km 分别为1.3 mol L21和0.7 mol L21。然而，Gofferje 等发现 Lipozyme IM 对甘油的亲和力几乎是油酸的7倍。

N435稳定性：酶的重复使用对于反应的经济可行性至关重要。因此，对于当前的反应系统(在先前描述的酯化条件下18) ，N435可重用

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