调节丙酮丁醇梭菌颗粒形成和孢子形成的agr群体感应系统外文翻译资料

 2022-08-08 11:08

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调节丙酮丁醇梭菌颗粒形成和孢子形成的agr群体感应系统

伊丽莎白·施泰纳、杰米·斯科特、奈杰尔·明顿和克劳斯·温泽

英国诺丁汉大学生物分子科学中心分子医学学院梭菌研究组

革兰氏阳性厌氧内孢子形成细菌丙酮丁醇梭菌具有相当大的生物技术潜力,因为它能够产生作为发酵产物的溶剂,特别是生物燃料丁醇。已知在葡萄球菌中构成一个基于环肽的群体感应系统中它的基因组包含一个假定的agr位点,agrBDCA,。在葡萄球菌中,产生肽信号所需的抗原决定簇,在细胞外积累时,由抗原决定簇编码的双组分系统感知。利用克隆技术,产生了丙酮丁醇梭菌ATCC 824的agrB、agrC和agrA突变体,并对其进行了表型鉴定。突变体和野生型显示出相似的生长动力学,并且在测试条件下溶剂形成没有明显差异。然而,在液体培养中由突变体形成的耐热内生孢子的数量减少了约一个数量级。在琼脂固化培养基上,孢子形成受到更强烈的影响,尤其是在琼脂和琼脂培养基中。类似地,淀粉样贮藏复合物颗粒在agrB、agrA和AgrC的菌落中几乎检测不到。重要的是,这些缺陷可以在基因上互补,证明它们与农业活动直接相关。发现由表达agrBD的菌株产生的扩散因子可恢复agrBD突变体中的颗粒和孢子形成。此外,基于丙酮丁醇梭菌agrD序列设计的合成环肽,当外源添加到培养物中时,也能够补充agrB突变体的缺陷。总之,这些发现支持了依赖agr的群体感应参与丙酮丁醇梭菌孢子形成和颗粒形成调节的假说。

革兰氏阳性内孢子形成细菌丙酮丁醇梭菌严格发酵,通过将糖和淀粉转化为有机酸和溶剂获得能量(5,17)。过去,它曾被用于丙酮和丁醇的大规模生产,但传统的工业发酵工艺目前在大多数国家被认为是不经济的,尽管油价不断上涨(16)。对于更有效的菌株和过程的工程来说,更彻底地理解生物体的生理和代谢是必不可少的(22)。

渗透代谢丙酮丁醇络合物。在分批培养的指数生长过程中,产生乙酸和丁酸,这使得细胞每分子葡萄糖获得3个以上的三磷酸腺苷。然而,随着培养基的酸碱度降低,未解离的酸扩散回细胞,从而影响细胞内的酸碱度,导致质子梯度耗散,持续产生酸会带来问题。为了避免酸死亡,细胞将其代谢转移到溶剂形成:一些产生的酸(主要是丁酸)被再次吸收,并与剩余的糖一起转化为丁醇、丙酮和一些乙醇(5,17)。这种向溶剂生产的转变与孢子形成的复杂发育程序的启动相一致。作为这些过程的一部分,一种被称为颗粒的淀粉样储存化合物被过渡形成并在细胞质中积累(35)。溶剂生成和孢子形成都是通过转录因子Spo0A连接的,Spo0A是孢子形成的主要调节因子:Spo0a对于溶剂生成梭菌(如枯草芽孢杆菌)中孢子形成的启动是必不可少的,但也是高溶剂产量所必需的(8,34)。相比之下丙酮丁醇梭菌中的枯草芽孢杆菌Spo0A不是通过复杂的磷系统激活的。相反,它的磷酸化状态通过直接相互作用由多个孤儿组氨酸激酶控制。调节枯草芽孢杆菌磷酸化Spo0A下游孢子形成过程的sigma;因子的整个级联存在于丙酮丁醇梭菌(2,18)中,尽管似乎存在一些差异(例如?Fby SpoIIE)。然而,虽然溶剂生成和孢子形成的一般条件是已知的,并且在解开潜在的调控网络方面正在取得进展,但是起始信号的化学或物理性质仍然有待阐明。

然而,有一些证据表明细胞间通讯(群体感应)系统广泛分布于梭菌属中(43)。并且它们可能在调节溶剂生成和孢子形成中起作用(3,20,21)。群体感应是一种通讯机制,依靠小的、可扩散的信号分子,允许细菌协调基因表达与细胞群体密度的变化(42)。大多数革兰氏阳性群体感应系统是基于分泌肽,可以是线性或环状的,有时包含大量翻译后修饰(23,39)。关于梭状芽孢杆菌属物种中这种系统的操作知之甚少,但是对于溶源性梭状芽孢杆菌糖丁酸梭状芽孢杆菌,在培养物上清液中的一种尚未鉴定的自生信号已被报道为诱导的溶剂信息素“低溶剂”突变体,这表明从酸到溶剂生产的代谢转变可能受到群体感应控制(20)。此外,电子分析表明agr型群体感应

2011年7月29日收到,2011年12月6日接受

2011年12月16日出版

通信地址:Klaus Winzer,klaus.winzer @nottingham. ac.uk,或Nigel P. Minton,Nigel . Minton @nottingham. ac.uk

本文的补充材料可以在http://aem.asm.org/.版权所有2012,美国微生物学会找到。保留所有权利。doi:10.1128/AEM.06376-11

统可能存在于梭菌纲的许多测序成员中(参考文献43和本实验室未公开的数据),尽管迄今为止,仅提供了三个物种的实验证据。在产孢梭菌、第一组肉毒梭菌和产气荚膜梭菌中,agr同源系统是高效产孢所必需的。在第一组肉毒杆菌和产气荚膜梭菌中,该系统也参与毒素生产的控制。

agr系统最早在金黄色葡萄球菌中被发现,它由5个基因构成:agrB,agrD,agrC和agrA(构成实际的细胞-细胞信号系统)和RNAIII(靶基因调控的主要效应因子)(优秀的评论见参考文献28)。一种环状的所谓的自动诱导肽(AIP)是通过膜相关蛋白agrB的作用从内部agrD片段衍生而来的,并充当信号分子。在细胞外积累时,AIP由组氨酸激酶agrC和反应调节剂agrA组成的双组分系统感知。磷酸化的agrA然后进一步激活agrBDCA操纵子,诱导RNAIII表达,但也独立于RNAIII控制靶基因。

有趣的是,丙酮丁醇梭菌是该属的成员之一,似乎拥有一个完整的agrBDCA簇(图1A),尽管还没有鉴定出类似于核糖核酸ⅲ的调节核糖核酸。与葡萄球菌系统相比,agrBD被预测为独立于agrCA转录,这得到了基因阵列时间进程序列的实验支持,该序列显示当细胞进入稳定期时,即刚好在溶剂

形成和孢子形成开始之前,agrB和agrD转录水平强烈增加,而agrCA表达保持相对恒定(参考文献1的补充材料中提供的微阵列数据分析)。

在这里,我们报道了ATCC丙酮丁醇梭菌824中agr基因座的突变分析。

材料和方法

细菌菌株和培养基。丙酮丁醇梭菌ATCC 824在含有80%氮气、10%氢气和10%二氧化碳的厌氧箱(唐·惠特利科学公司MG1000厌氧工作站)中于37℃生长。梭状芽孢杆菌菌株在梭状芽孢杆菌基础培养基(CBM) (29)或2times;YTG(胰蛋白胨,16g/L;酵母提取物,10g/L;氯化钠,5g/L;葡萄糖,10g/L;琼脂固化培养基的PH调节至5.8,肉汤的PH调节至5.2)。大肠杆菌TOP10(用作ClosTron和互补质粒的宿主)在Luria-贝尔塔尼培养基(37)中于37℃生长。抗生素的使用浓度如下:氯霉素,25micro;g/ml;红霉素,10micro;克/毫升(CBM)还是40micro;g/ml (2times;YTG);甲砜霉素,15micro;g/ml。

质粒,引物,DNA技术。寡核苷酸是由德国欧芬MWG操纵子公司合成的(见补充材料中的表S1)。聚合酶链反应扩增使用故障安全聚合酶链反应系统(震中)或脱氧核糖核酸聚合酶(新英格兰生物实验室)进行。如前所述进行丙酮丁醇梭菌的电穿孔(38)。质粒分离和基因组DNA制备分别使用QIAprep微型制备试剂盒(Qiagen,英国)和DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)进行。限制性内切酶由新英格兰生物实验室提供,并根据制造商的说明使用。标准方法用于琼脂糖凝胶电泳和大肠杆菌的转化(37)。

利用克隆技术构建突变体。突变体的构建是基于一个修饰的团簇II中心(theClosTron),它携带一个能整合到宿主染色体特定位点的电阻标记。突变体使用Heap等人(10,12)描述的标准方法,在乙酰丁基梭菌ATCC 824中构建靶向基因agrB (cac0078)、agrC (cac0080)和agrA (cac0081)。用于重定位内含子的IBS、EBS1d和EBS2引物列于表S1(在补充材料中)。引物名称中的数字表示使用的重定位位点。将聚合酶链反应扩增的重定位HindIII/BsrGI片段克隆到pMTL007C-E2载体中。对来自推定的agr突变体(AgRb::CTermB、AgRc::CTermB和AgRA::CTermB)的基因组DNA进行两次PCR筛选。首先,使用插入位点两侧的引物来确认内含子存在于所需的靶基因中(引物对,分别为agrB、agrC和agrA的CAC0078-F/CAC0078-R,CAC0080-F/CAC0080-R和CAC0081-F/ CAC0081-R)。为了确认内含子存在的方向,使用了在内含子-外显子连接处扩增的引物(引物对,CAC0078-R/EBS universal,CAC0080-F/EBS universal,以及CAC0081-R/EBS universal分别用于agrB、agrC和agrA)。

互补载体的产生。突变株的互补载体包含agrA、agrBD、agrC和agrCAtogether的完整编码序列及其各自的推定启动子区。对于agrBD簇,同源基因间上游区域被认为是启动子的宿主。对于agrCA簇,grCwas起始密码子上游的224-bp区域被认为包含必要的调控元件。编码序列,包括其推定的启动子区域,从基因组DNA中进行聚合酶链反应扩增。分别用引物对agrBD-F/AgrBd-rAnDarca-F/agrC-R扩增AgrBd和AgrC区。用XhoI和BamHI消化扩增的片段,并亚克隆到用相同酶线性化的pMTL85141载体(11)中。利用引物对agrCA-F/agrC-R和agrCA2-F/agrA-R,将包含224-bp上游区域的agrCA簇扩增为两个片段。利用SaCOiRecognititionSiteInTheagrGene,这两个片段分别用XhoI/SacI和SaCI/BaHi消化,并连接到XHOI/BaHi线性化的pMTL85141载体中。为了表达agrA,利用引物agrA-F/agrC prom-R(在AgrC的起始密码子引入一个NdeI位点)扩增agrA簇的推定启动子区,并利用引物对agrA-F/agrA-R(在agrA的起始密码子引入一个NdeI位点)扩增AgrA基因。在三片段连接步骤中,将XHOI/NDEID化的启动子区和NdeI/BamHI消化的agrA片段引入XhoI/BamHI线性化的pMTL85141。所有互补质粒都通过测序进行了验证。

孢子分析。丙酮丁醇梭菌在含有0.5% CaCO3和5%葡萄糖的5 ml CBM肉汤中生长,以使孢子形成。五天后,一个200-micro;l将1份培养物样品加热至80℃10分钟。进行系列稀释,10-micro;l将1份热处理过的细胞悬液铺在CBM琼脂上。孵育24小时后计数菌落。

颗粒检测。为了评估颗粒的积累,将丙酮丁醇梭菌培养在含有5%葡萄糖的琼脂-固体培养基上,以促进颗粒的积累。孵育24小时至48小时后,将平板暴露于碘蒸气中,将含有颗粒的菌落染成深棕色(36)。

通过交叉划线检测可扩散信号。通配符。actetobuytlicum和agr突变体在CBM肉汤中预培养,直到可检测到可见的生长。接种环用于在CBM-G板上划线这些细胞悬浮液,产生大约7毫米宽的条纹,并注意条纹是物理分离的。孵育48小时后,如上所述对平板进行碘染色。

agrB突变体的化学互补和AIPs的检测。肽蛋白研究有限公司(英国法勒姆)合成了环状AIPs并进行高效液相色谱纯化;纯度估计在78%到90%之间,这取决于AIP。冻干肽溶解在二甲基亚砜(DMSO)中,得到1 mM储备溶液。

丙酮丁醇梭菌的群体感应

图1丙酮丁醇梭菌agrBDCA簇的示意图(A)和已确认和推定的AgrD序列的比对(B)。(A)丙酮丁醇梭菌agrBDCA簇被预测包含两个独立的转录单位(由虚线箭头指示),agrBD和agrCA。(二)比对显示了实验证实的突变蛋白。金黄色葡萄球菌(AgrD至ⅳ组),粪肠球菌(LsrD),andL。植物乳杆菌(LamD),以及从其他物种中选择的推定AgrD序列。后者包括以下(如果可用,括号中给出了基因座标签,并在比对中确定了各自的序列):丙酮丁醇梭菌(CAC0079)、纤维素梭菌743B (Clocel_1234、Clocel_1319和Clocel_4254)、蜡状芽孢杆菌G9241 (BCE_G9241_0529)、innocua Lister clip 11262(Lin 0042)、单核细胞增生李斯特氏菌EGD-e(Lmo 000)sakei 23K (LSA1504)、艰难梭菌QCD-23m63 (CdifQCD-2_01797)、纸屑梭状芽孢杆菌DSM 2782 (Cpap_1451和Cpap _ 2,后者未注明)、纤维素分解梭状芽孢杆菌H10 (Ccel_2126)、羧二孢梭状芽孢杆菌P7 (CLCAR_0954)、肉毒杆菌ATCC 3502 (CBO0332A和CBO0339)、克鲁梭状芽孢杆菌未注释),c . beijernicki NCIMB 8052(Cbeij 1;未注明)、产气荚膜梭菌SM101 (CPR_1531)、艰难梭菌QCD-66c26 (CdifQC_16513)、艰难梭菌630 (CD2749A)、糖解梭菌WM1 (Closa_2479)。黑色三角形表示已确认和已提议的进程,它拥有环编码部分的流。一个高浓度的脯氨酸,存在于所有序列中,是灰色的。请注意紧接在建议的切割位点下游和保守的脯氨酸上游的序列保守性。对于每个AIP基团,恒等式(*)、保守(:)和半保守取代(。)被显示。构成已确认的禽流感病毒的氮末端的氨基酸用下划线标出。数字表示AgrD序列的总长度。

对于肉汤中的互补研究,agrB::CTermB菌株在立方氮化硼中生长到600纳米的光密度为0.4到0.5。然

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