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由功能化多壁碳纳米管与醇溶蛋白/壳聚糖@聚氨酯合成的微环境用于骨细胞再生
摘要：
一种基于仿生的方法，特别是人工支架，已经建立了巨大的潜力提供组织再生能力和有效的途径，以弥补宿主细胞反应和器官需求之间的差距。然而，当生物材料的功能行为与自然细胞外基质最相似时，其合成效率最高。本研究通过将醇溶蛋白和壳聚糖(CS)整合到与功能化多壁碳纳米管(fMWCNTs)结合的聚氨酯(PU)中，构建了一种纤维支架，作为骨细胞修复材料。含有0.1 mg/mL fMWCNTs的壳聚糖为基础的组织工程支架显示出强大的协同效应，通过提高生物力学强度、亲水性和抗菌效果，可以产生类似于骨细胞微环境中真正天然的细胞外基质的支架。该支架可通过生物界面实现细胞与细胞之间的快速通讯，极大地促进了前成骨细胞(MC3T3-E1)的再生作用，在我们的体外实验中体现在细胞的生长、增殖和分化方面。茜素红染色分析、碱性磷酸酶活性和Western blotting也证实了羟基磷灰石(HA)纳米晶体的成核和成骨蛋白标记物的表达，所有这些都表明支架具有优良的成骨诱导性能。这些结果表明，这种精心设计的PU/Zein/CS-fMWCNTs纤维支架具有合适的生物学行为，可作为人工骨细胞外基质，确保骨细胞再生，同时为人工骨移植领域带来诸多好处。
- 介绍
作为生物植入物的组织工程支架的出现标志着组织工程的一个新时代，该时代能够取代传统的自体移植和同种异体移植，实现组织再生和器官功能恢复(McDermott et al.， 2019;Shrestha, Shrestha, Baral等，2019年)。摘要在骨组织工程中植入仿生器官是一种使骨细胞功能化或修复因创伤、损伤或疾病引起的骨细胞损伤的选择。根据2018-2025年全球机会分析和行业预测，为满足日益增长的人工骨移植和替代产品的需求，预计到2025年，市场投资将达到39.12亿美元。研究人员正致力于开发骨取代物，通过其成骨和骨诱导行为，促进骨修复或愈合。骨细胞特异性生物支架具有生物降解性、成骨诱导性、血管化孔隙率和免疫惰性等特性，模拟天然骨细胞外基质的微环境和骨细胞的骨整合行为(Jahan, Mekhail， amp; Tabrizian, 2019;Lee, Shrestha, Shrestha, Park, and Kim, 2020;Martine等人，2017)。多种技术已被用于开发纳米/微结构的多孔支架，可通过宿主骨细胞和支架基质之间的细胞间通讯促进骨细胞再生和骨修复(Suvarnapathaki, Wu, Lantigua, Nguyen， amp; Camci-Unal, 2019;Zhang, Skelly, Maalouf, Ayers, and Song, 2019)。近年来，静电纺支架的制备使用生物活性材料，包括生物生长因子，这些对氧气的供应，营养物质的扩散，和提供具有适当孔隙度和强大生物力学性能的成骨环境(Balagangadharan, Trivedi, Vairamani， amp; Selvamurugan, 2019)。大量的合成和天然聚合物，典型的聚己内酯(PCL)、聚氨酯(PU)、聚丙烯腈、聚L-乳酸(PLLA)、壳聚糖、明胶、纤维素和丝绸已被研究作为细胞界面静电纺支架用于骨组织再生(Shrestha, Shrestha, Lee等，2019;张等，2018)。这些组织工程骨模型忠实地模拟了组织-植入物界面的原生细胞外基质。然而，由于它们的机械强度低，化学不稳定，代谢活动中对离子转移的高阻抗，要获得更好的体外和体内实验结果，仍然面临着更多的挑战。因此，复杂的微/纳米纤维复合材料是完美修复骨损伤或永久治愈骨缺损患者致残的首选材料。仅在支架制作中使用聚氨酯会产生主要的局限性，其降解缓慢，容易受到细菌和病毒的影响，其疏水性会阻碍细胞界面的相互作用。然而，它的高弹性模量和生物相容性是其内在特性，常使其成为开发硬组织生物材料的基础。因此，表面修饰和多功能重组是提高仿生材料生物医学应用成功率的最佳途径(Guan, Fujimoto, Sacks， amp; Wagner, 2005;Shrestha等人，2017年)。在我们之前的研究中，壳聚糖/聚酰胺纤维生物材料提供了适当的细胞微环境，有助于骨细胞活性的调节(B. K. Shrestha, Mousa等，2016)。壳聚糖上的极性基团通过羟基或胺基交联在聚酰胺链上，增强了杂化材料的生物行为。重要的是，壳聚糖中大量的螯合基团显示出了使大多数骨基质成核的能力，如Ca2 、Mg2 、Zn2 和蛋白质，这些基质负责诱导骨细胞分化和骨修复。多糖是一种非常合适的生物材料，可以很容易地对骨组织做出反应。壳聚糖是一种天然多糖，具有某些基本特性(例如其凝胶形成能力、孔隙率、成骨诱导性和生物降解性)，有助于骨细胞的再生能力，通过成骨细胞分化加速骨组织修复(Pellacute;a等，2018年)。在过去的十年中，骨生长因子，包括骨钙素、骨形态发生蛋白、I型胶原、骨涎蛋白(BSP, I/II)、IGF-1和IGF-II，都已被用于工程骨组织诱导骨修复(Deepthi, Nivedhitha Sundaram, Deepti Kadavan， amp; Jayakumar, 2016;索尔海姆,1998)。然而，这些增长的经济负担很高，使得它们在开发合成支架时只能作为有限的资源。与此相反，玉米醇溶蛋白(含有多聚谷氨酰胺肽的玉米蛋白)在促进骨细胞分化方面表现出了良好的性能，并作为纳米载体应用于药物传递，而不是使用天然骨生长蛋白(Yue Zhang, Li, Lan， amp; Wang, 2017)。这种天然蛋白具有抗氧化和抗菌能力，并与羟基磷灰石形成共价键和电价键，同时作为骨诱导材料(Ru et al.， 2018)。值得注意的是，玉米醇溶蛋白中的谷氨酰胺诱导免疫系统在有丝分裂活动中支持淋巴细胞的生长，它也是嘌呤和嘧啶合成的氮源，这对细胞活动中DNA和RNA的合成是必不可少的(Newsholme amp; Calder, 1997;Szondy amp; Newsholme, 1989)。基于醇溶蛋白的支架呈现出一种具有互联网络的多孔结构;这种框架有助于细胞的浸润、迁移和增殖。例如，F. Wu等人制备的zein/PCL多孔支架已被证明具有成骨性(Wu, Wei, Liu, O Neill， amp; Ngothai, 2012)。当涉及到细胞界面的细胞相容性时，这种智能生物活性支架由于其更高的效率，预计需求将会上升。此外,微碳纳米管(热合),与不同的有机/无机纳米材料功能化半个肽、羟基,硫化,和羧基组,能有效刺激生物分子,已用于脚手架准备骨细胞生长,以及防止骨吸收(Hirata et al ., 2011;Li等人，2012)。在支架中加入CNTs的分形纳米结构增强了其导电性、机械强度和亲水性，从而提高了支架的生物活性(Yu, Files, Arepalli， amp; Ruoff, 2000)。在支架中使用MWCNTs已被证明可以抑制体内破骨细胞骨吸收，这表明MWCNTs对骨细胞生长有积极作用(Narita et al.， 2009)。因此，基于fmwcnts的纳米结构支架通过提供足够的孔隙率和较大的表面体积比来吸附骨生长因子，旨在改善生物特性，并类似于天然骨ECM作为再生干细胞生态位。因此，该支架可作为组织再生平台，并允许在生物工程中使用一种新方法。在本研究中，我们精心设计了一种基于多糖和蛋白质的新型复合材料(PU/Zein/CS- fMWCNTs)，并采用静电纺丝技术制备。这种方法可以制造用于骨组织工程应用的纤维支架。通过整合表面修饰的多壁碳纳米管，生物材料的物理化学和生物活性得到进一步改善，这些都是成功的细胞-支架相互作用的必要特性，包括营养物质的扩散、细胞附着、增殖和分化。体外，前成骨细胞(MC3T3E1)细胞研究和骨诱导标记物(蛋白)表达的增加证实了支架优异的骨整合行为。我们认为，所制备的支架可以作为一种类似于骨ECM的生物材料来刺激成骨细胞，进而促进骨再生和新骨形成。2. 材料与方法材料壳聚糖(中等分子量，去乙酰(75-85)%)、玉米醇溶蛋白(玉米)和三氟乙酸(TFA)购自美国Sigma-Aldrich化学公司。获得的聚氨酯颗粒(美国路博润先进材料公司)。MWCNTs(外径约10.85 nm)购自韩国Nanosolution Co. Ltd.，其表面壁用羧基功能化。(B. K. Shrestha, Ahmad et al.， 2016)但与原始多壁碳纳米管相比，fMWCNTs的外径(asymp;9.47 nm)没有明显变化(SI的图s1)。所有的化学品和材料都是分析级的，使用时没有进一步净化。
- 材料和方法
2.1材料
壳聚糖(中等分子量，去乙酰(75-85)%)、玉米醇溶蛋白(玉米)和三氟乙酸(TFA)购自美国Sigma-Aldrich化学公司。获得的聚氨酯颗粒(美国路博润先进材料公司)。MWCNTs(外径约10.85 nm)购自韩国Nanosolution Co. Ltd.，其表面壁用羧基功能化。(B. K. Shrestha, Ahmad et al.， 2016)但与原始多壁碳纳米管相比，fMWCNTs的外径(asymp;9.47 nm)没有明显变化(SI的图s1)。所有的化学品和材料都是分析级的，使用时没有进一步净化。
2.2纤维支架的制备
采用静电纺丝法制备了不同组分的静电纺丝膜。fMWCNTs(0.1毫克/毫升)优化基于机械强度和浓度纳米纤维形态分散在组织了30分钟,其次是添加壳聚糖和玉米蛋白在不断搅拌3 h。组织作为一种新型溶剂显示了巨大的优势能够溶解有机基质/聚合物,作为酸催化剂,促进肽键的形成。壳聚糖和玉米蛋白完全溶解后，加入PU(重量为4.0 wt.%)，再次搅拌12 h，得到精细的静电纺丝溶液。在静电纺丝前，以可纺溶液为基础，优化壳聚糖(1.0 wt.%)和玉米醇溶蛋白(1.5 wt.%)的质量比例，制备出粒径相对均匀、无珠的多孔网状静电纺丝纳米纤维。静电纺丝法制备PU/Zein/CS-fMWCNTs纤维支架。类似的技术被用于制备其他静电纺丝支架(例如，纯PU和PU/Zein/CS)。将制备好的纤维支架在40℃下真空干燥24 h，研究其理化和生物学特性。
2.3特性描述
2.3.1物理化学和形态学特征
场发射扫描电子显微镜(FE-SEM, Carl Zeiss Supra-40 VP Germany, at Centre for University- wide Research Facilities (CURF) of Chonbuk National University, Jeonju)用于观察纳米纤维支架的形貌。高分辨率透射电子显微镜(HR-TEM, JEM-JEO(2010日本，在200 kV)，和Cs校正扫描TEM (Cs- STEM;使用JEOL/JEM-ARM, 200 F)研究了fMWCNTs、纯MWCNTs和PU/Zein/CS-fMWCNTs纳米纤维的形貌。利用x射线衍射(XRD, Rigaku Japan)检测了材料的结晶度，Cu靶在波长(lambda;) 0.154 nm, 2theta;范围(10 - 90)◦，扫描速度为5◦/min。用红外光谱仪(Perkin Elmer Spectrum GX, USA)测量了纯材料和复合材料的傅里叶透射红外(FT-IR)光谱。使用通用试验机(MTDI Inc.)对不同纤维支架(标准狗骨形状)的典型应力/应变性能进行评估。韩国)。纤维支架的润湿性在NTP测量。利用韩国TA仪器对可纺溶液进行了热重分析(TGA)，测定了各组分可纺溶液的电导和粘度。
2.3.2体外生物降解分析
不同样品的降解能力等质量(25 mg, n = 3)在37◦C磷酸盐缓冲盐水(PBS at10X, pHasymp;7.4)评估，如之前所述(S. Shrestha等，2018)。简单地说，将每个干燥的支架浸入30ml PBS中，然后以100rpm摇晃不同时间间隔孵育至16周。每3天更换一次新的PBS溶液。在预定的时间间隔内，样品小心地从溶液中取出，用蒸馏水冲洗三次以完全去除任何缓冲盐，然后在称量前冻干。通过形貌分析(使用FE-SEM图像)证实了样品的体外降解。定量,退化也评估了计算体重的下降百分比,从关系:减肥(%)= (w0minus;w1 w0)times;100,w0和w1代表初始重量(孵化之前)和最终的重量(在PBS孵化后对于一个给定的时间)的样本,分别。此外，还进行了酶生物降解试验(Ruan et al.， 2016)。测量不同支架的干重(w0)，在上述条件下用含有500 mu;g/mL溶菌酶的PBS (0.1 M)孵育2周、4周和6周。酶的浓度根据ASTM标准(F-1635-950)。不同时间间隔后，用去离子水清洗支架多次并冻干。冻干支架分别称重(w1)。用上述关系量化支架的降解情况，以减重百分比表示，并通过FESEM图像进行证实。
2.3.3生物矿化研究
作为骨组织界面的建筑材料，体外生物矿化，例如无机材料，主要是钙和磷在不同支架上以纳米晶体形式形成的羟基磷灰石(HA)核，进行了评价。纯PU纤维垫，PU/Zein/CS和PU/Zein/CS- fmwcnts静电纺垫(n = 3)在(2厘米times; 2厘米)等大小分别在37◦C模拟体液(pH 7.2)溶液中孵育(1、3、5、7和14天)。用Hank balance salt (Sigma-Aldrich, USA)将无机盐MgSO4 (0.097 g)、NaHCO3 (0.35 g)和CaCl2 (0.185 g)溶解在蒸馏水(1 L)中制备SBF溶液。每隔2天更换一次新的SBF溶液。随后，将矿化支架用蒸馏水清洗数次，干燥，并用FE-SEM成像和能谱仪(EDAX)检查，以确认HA的沉积。
2.3.4抗菌活性研究抑菌圈测量
在该测试中,纯PU的实际上电纺垫,PU /玉米蛋白/ CS,和PU /玉米蛋白/ CS-fMWCNTs测试对不同细菌,如大肠杆菌(大肠杆菌),金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌)、微球菌危害(m
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