碳氢化合物氧化引起的钙乙酰不动杆菌SOD的表达及活性氧的产生外文翻译资料

 2022-08-15 02:08

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摘要

在两种烃降解微生物钙不动杆菌中研究了在各种烃存在下抗氧化酶[超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶]的表达以及活性氧（ROS）的产生与水（VKPM B-10353）和底部沉积物（EMBM-06）隔离。通过所研究的菌株对烃类进行生物转化后，观察到细菌细胞超氧化物生成的增强和培养基中过氧化物的积累。在微生物与柴油（分别增加12倍和2倍），环己烷（1.8倍和1.75倍），苯和蒽的混合物（4.4倍和3.7倍），萘（8倍）温育过程中发生了最强的超氧阴离子自由基生成。分别在VKPM B-10353和EMBM-06菌株中分别提取了1倍和1.9倍）和苯并（a）（（2倍和2.3倍），在VKPM B-10353菌株中是蒽（2.8倍）。两种菌株在柴油生物转化过程中都会在培养基中积累过氧化物。在含碳氢化合物的培养基中，细胞中SOD的活性显著增加，过氧化氢酶的活性降低。癸烷和原油对SOD表达的影响最大。癸烷使菌株VKPM B-10353和EMBM-06的SOD表达分别增加24.4倍和28.5倍。原油使VKPM B-10353菌株的SOD表达增加了19倍，使EMBM-06菌株的SOD表达增加了16倍。作者认为，在各种碳氢化合物的生物转化过程中，细菌中ROS生成的增加和氧化应激的发展可能具有适应性。并在EMBM-06菌株中接种16次

关键词：碳氢化合物、氧化应激、活性氧、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶不动杆菌

介绍

近年来，已经发表了许多研究的数据，表明芳香烃及其衍生物的第一个氧化阶段（Lee，1999； Tamburro等，2004），烷烃（Kato等，2009； Gogoleva等，2012） ，二苯基及其氯衍生物[多氯联苯（PCB）；庞塞等。2011 ]，各种微生物的芳香化合物的硝化衍生物（Peacute;rez-Pantoja等，2013）可能伴随着活性氧（ROS）的形成。

加藤等人研究（2009年）表明，在与烷烃一起孵育的过程中，油生物降解性嗜热细菌热芽孢杆菌 B23中诱导了乙酰辅酶A-氧化酶，过氧化氢酶和超氧化物歧化酶（SOD）。乙酰辅酶A氧化酶形成ROS，过氧化氢酶和超氧化物歧化酶，在烷烃的beta;-氧化初期，保护细胞免受ROS的毒性作用。这些过程在功能上类似于真核过氧化物酶体中发生的过程。

Gogoleva等人（2012年）报道过，在以柴油为碳源的矿物培养基中，石油生物降解微生物如地瓜（Gordonia terrae），红球红球菌（Rhodococcus rubropertinctus）和红球红球菌（Rhodococcus erythropolis）的培养过程中发生过氧化物的积累。

正如我们之前所显示的，在含原油的培养基上培养两株钙乙酸不动杆菌菌株后，细菌细胞中自由基过程的水平增加了（Sazykin等，2011）。

即进行芳族底物氧化的初始阶段，并能够氧化类似基材的加氧产生活性氧为故障反应的高频的结果（李1999 ;佩雷斯-潘托哈等人2013）。抗氧化剂和抗氧化剂复合酶可以改善相似底物的生物降解（Tamburro等人2004； Kang等人2007； Ponce等人2011）。

然而，另一份报告指出，在存在抗氧化剂的情况下，油烃的氧化作用可能会加剧（Sazykin和Sazykina 2013）。

因此，微生物产生的ROS在烃氧化中起着双重作用。

一方面，它们引起氧化应激（Kang等，2007）并破坏细菌细胞的各个组成部分（Lee，1999），这是导致细胞死亡和微生物繁殖减速的原因。

另一方面，由ROS介导的DNA损伤引起了诱变剂SOS反应，并加速了新菌株的进化，这些新菌株能够氧化较早接触不到的底物（Peacute;rez-Pantoja等人，2013年）。

显然，取决于污染物的定性和定量结构，某些影响可能会占上风，但是总的来说，过量生成ROS的策略可以促进微生物的扩展和新生态位的发展（Lee 1999； Kang等，2007；Peacute;rez- Pantoja等人，2013年）。

不幸的是，致力于研究ROS在烃类生物转化中的作用的出版物数量有限，尽管类似的研究也可以澄清一个有趣的问题，即化合物的新陈代谢不能被缺乏相应酶系统的细菌利用。

这项工作的作者认为，微生物对碳氢化合物和异种生物素进行生物转化后，自由基过程的增加水平可以产生表面活性剂并提高疏水性底物的生物利用度。此外，由于缺乏用于烃转化的酶促体系的细菌利用ROS增强了烃底物的氧化作用，因此氧化应激具有适应性（Peacute;rez-Pantoja等，2013）。

在这项工作中，已经研究了SOD和过氧化氢酶表达的可能变化，以及两株石油降解微生物钙不动杆菌对各种烃类进行生物转化后超氧阴离子和过氧化氢的生成水平。根据本文的作者，类似于氧化应激的适应机制可能是氧化细菌酶系统不敏感的多种底物的一种重要的通用方法。

方法

方法

菌株和微生物培养

本研究采用了从亚速海刻赤海峡表层海水（VKPM B-10353）和底层沉积物（EMBM-06）中分离的两株不动杆菌。。以碳氢化合物或原油为碳源，在碱性矿物盐介质中进行实验。介质的组成见表1。使用前向碱性矿盐介质中加入2ml/L微量元素储备液（表2）。初始pH值调整为6.8。将培养基按15毫升的量分配到50毫升的锥形烧瓶中。烧瓶在旋转摇床培养箱Innova 40R（加拿大新不伦瑞克）中培养，程序设定为170转/分和30°C。悬浮的微生物细胞数量通过DEN-1B浊度计（拉脱维亚Biosan）估算。

碳氢化合物

在这项工作中，使用了单个碳氢化合物[正戊烷，正癸烷，正十六烷（HD），石蜡，环己烷，苯，萘，蒽，苯并（a）re（BAP）分析级（“ Aquatest”，俄罗斯） ，原油和商用柴油“ Euro C”]。从原油中分离出树脂和沥青质馏分，加入40倍体积的戊烷，然后在14000 g下离心并干燥颗粒。固体烃，戊烷，苯和环己烷以在正十六烷中的溶液形式使用。石蜡，萘，戊烷，苯和环己烷为10％溶液，蒽为0.25％溶液，BAP，树脂和沥青质馏分为0.1％溶液。

微生物对SOD和过氧化氢酶的表达

在50ml锥形烧瓶中加入15ml碱性矿物盐培养基，并加入1%（150mu;l）的碳氢化合物。以添加0.5%酵母抽提物和0.5%胰蛋白酶原的碱性矿盐培养基烧瓶为对照。培养前培养基中的细菌细胞数量为1times;108个/ml。在摇瓶培养箱（30°C，24小时）中培养微生物。通过离心15分钟（6000 g，4℃）获得细菌细胞。将小球悬浮在0.85%NaCl溶液和0.1%Triton X100中，在37°C下培养15分钟，并定期摇动，制备细胞裂解物。根据孙毅等人的研究结果，估算了SOD的活性。方法（1988）。根据Goth法（1991）估算过氧化氢酶活性。在孵育终止时，每1毫克细菌总蛋白计算酶活性。根据Lowry方法估算细菌细胞裂解液中的蛋白质浓度（Lowry等人。1951年）。三个独立的实验分别重复五次。

微生物产生的超氧阴离子自由基

对于该实验，微生物在碱性矿物盐培养基上生长18小时，添加0.5％的酵母提取物和0.5％的胰蛋白p。然后将微生物悬浮液在碱性无机盐培养基中洗涤3次，并用相同的培养基稀释至每毫升1times;10 8个细胞的浓度。

为了评估微生物与碳氢化合物一起温育后产生的超氧化物，使用了COSTAR 3632 96孔微孔板（美国）。引入100mu;l的培养悬浮液，80mu;l的碱性矿物盐培养基，10mu;l的4-mM去离子水润黄蛋白溶液（Sigma-Aldrich，美国）和10mu;l的相应烃。

将100mu;l悬浮培养液，90mu;l基本矿物盐培养基（添加0.5％的酵母提取物），10mu;l光泽精蛋白在去离子水中的4-mM溶液添加到对照中。三个独立的实验分别进行八次重复。

将该板放入Luminoskan Ascent板发光仪（Thermo Scientific，美国）中，在30°C的温度下孵育24小时，同时每30分钟进行一次化学发光（CL）强度测量（总共48次测量）。

微生物产生过氧化氢

在50ml锥形烧瓶中加入20 ml碱性矿物盐培养基，并加入2%（400mu;l）碳氢化合物。以添加0.5%酵母抽提物和1%胰蛋白酶原的碱性矿盐培养基烧瓶为对照。培养前培养基中的细菌细胞数量为每毫升1times;10六次方个。微生物在摇瓶培养箱中以30°C、170转/分的速度培养30天。为了评估过氧化氢，从烧瓶中取出培养液样品，并以14100 g离心5分钟。将60mu;l培养基上清液，100mu;l磷酸盐缓冲盐水（PBS）和20mu;l鲁米诺引入平板孔中。在Luminoscan Ascent微孔板光度计上进行了八次CL测量，在100s内以1s的间隔测量了每口井的发光。测量开始时，通过内置分配器将20mu;l辣根过氧化物酶溶液（0.01 u/mu;l）引入每个板中。对于每次测量，计算平均CL强度，然后使用最大平均CL值。

统计

所有数据均采用Microsoft Excel中未配对的学生t检验进行分析；p值小于0.05被认为具有统计学意义。

结果

过氧化氢酶和SOD表达的变化

EMBM-06和VKPM B-10353菌株的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性估计结果如图1a和B所示。当单个碳氢

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