耐重金属酵母液隐球菌 N6菌株铜/锌超氧化物歧化酶基因的克隆与功能鉴定外文翻译资料

 2022-08-15 02:08

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耐重金属酵母液隐球菌 N6菌株铜/锌超氧化物歧化酶基因的克隆与功能鉴定

ShinKanamasa·KoichiroSumi·NahoYamuki·TakashiKumasaka·TakeshiMiura·FumiyoshiAbe·SusumuKajiwara

摘要

深海酵母液隐球菌菌株N6具有高超氧化物歧化酶（SOD）活性和对金属离子的高耐受性。为了阐明该菌株中金属耐受性与SOD活性之间的关系，我们克隆了Cu/ZnSOD基因。该基因（Cl-SOD1）由471个bp组成，编码157个氨基酸；该蛋白与其他酵母种Cu/ZnSOD蛋白的同源性为59.9%-76.7%。最高的同源性对应于Cryptococcusgattii隐球菌（76.7％）。在酿酒酵母的sod1突变体中Cl-SOD1表达表明，该SOD蛋白在酿酒酵母中有一定的功能。在30°C时，Cl-SOD1蛋白的活性比酿酒酵母SOD1(Sc-SOD1)高约4倍。在铜离子存在下，菌株N6中的Cl-SOD1蛋白的mRNA的量增加。然而，该转录物的水平不取决于铜离子浓度的增加与否，并且与Cu/ZnSOD蛋白量的变化没有很好的相关性。这一结果表明，N6菌株具有其他Cu/ZnSOD基因，其诱导方式与白色念珠菌中的Cl-SOD1不同，或者Cl-SOD1基因在铜离子增加时经历转录后调控。

关键词：耐铜性；深海酵母；酶活力；基因表达；基因克隆

介绍

深海地区是一个高压环境，其静水压力升高，有利于水和二氧化碳等分子的离子化（Iwahashi等人，1993；Abe等人，1999）。通常，大多数深海地区的温度范围为1至3°C（Kato和Qureshi 1999）。生活在深海中的生物能够在这些极端条件下生存，并且可能含有具有独特性质的有用酶。

深海中存在原核和真核微生物，此前，我们报告了从日本海沟收集的沉积物样品中分离出的大量酵母菌株，深度为6500米（Abe等人，2001）。其中一个菌株，最近通过对26SrDNA基因的测序鉴定为隐球菌液化菌株N6（Abe等人，2006;Minegishi等人，2006），该菌株对重金属，特别是铜离子具有耐受性，并能在含有50mMCuSO4的介质中生长（Abe等人，2001年）。观察到的重金属耐受性归因于对深海沉积物的适应，该沉积物通常包含通过地热喷口等手段从地球内部带入地表的重金属。细胞提取物的酶促分析结果表明，菌株N6的超氧化物歧化酶（SOD）活性是由铜离子的存在诱导的，并且在10mMCuSO4存在下比其他隐球菌物种的活性更高（Abe等2001）。因此，菌株N6的SOD可能在其对重金属的耐受性中发挥作用。但是，尚未克隆菌株N6的SOD基因，也未纯化SOD蛋白。

SOD是金属酶，通过将超氧自由基转化为过氧化氢和氧气来解毒氧自由基，从而形成主要的细胞抗氧化防御系统。SOD也可防止由超氧自由基介导的铜、铁等离子的还原及随后的羟基自由基生成（Fridovich ，1978；Trush和Kensler，1991）。这些酶根据其活性位点金属的需求分为三种形式：Cu/ZnSOD，MnSOD和FeSOD。在真核细胞中，Cu/ZnSOD主要位于细胞质中，而MnSOD主要存在于线粒体中。FeSOD存在于原核生物，几种植物和原生生物中。显然，Cu/ZnSOD与FeSOD或MnSOD截然不同，且在结构上不相关（米勒，2004）。

Cu/ZnSOD在芽生酵母酿酒酵母中得到了广泛的研究。酿酒酵母Cu/ZnSOD(Sc-SOD1)占细胞SOD总活性的90-95%(GrallaandValentine1991)。人们认为这种酶可以保护细胞免受线粒体呼吸所产生的活性氧（例如羟基和超氧自由基）的侵害（Gralla和Valentine， 1991；Jamieson 1998）。Sc -SOD1被铜分子伴侣激活，该分子伴侣促进了铜与Sc -SOD1的结合（Wei等，2001），因此这种酶可以被认为是金属螯合剂以及防止细胞氧化应激的酶。编码铜/锌超氧化物歧化酶的基因已经从几种真菌中被克隆和鉴定，如棉阿舒囊霉（Dietrich等人，2004），黑曲霉（Holdom等，只在数据库AF281059出版），烟曲霉（Holdom等人，2000），构巢曲霉（Oberegger等，2000），球毛壳菌（Birren等人发表，只在数据库EAQ89781），麦角菌（Moore等，2002年），Hansen隐球菌（Hernandez-Saavedra等，1998），扣带状肾小球（Clark等，仅在数据库AF076951中公开）和中华绒螯蟹（Park等，仅在数据库AY438328中公开）。该基因编码酿酒酵母酶已被克隆和鉴定(Bermingham-McDonogh等，1988年 ;Chang等，1991 ;Hernandez-Saavedra等，1998年，2001年）。在一种人类致病酵母--白色念珠菌，对Cu/ZnSOD进行了鉴定（Hwang等，1999年，2002年），最近，在该酵母中报道了编码Cu/ZnSOD酶的四个基因（SOD1，SOD4，SOD5和SOD6）（Martchenko等，2004年）。此外，三种致病性新生隐球菌酵母菌株（包括新生隐球菌gattii，最近被重新归类为gattii隐球菌）的Cu/ZnSOD已经被纯化（HamiltonandHoldom， 1997），而且那些基因（SOD1）被克隆。此外，还对Gattii的sod1突变体进行了表征(Chaturvedi等人，2001;Narasipura等人，2003）。对新型隐球菌全序列基因组的BLAST研究表明，该菌株只有一个Cu/ZnSOD基因，被认为对宿主的氧化机制具有保护作用（Chaturvedi等人，2001）。然而，只有少数真菌Cu/ZnSOD蛋白得到了广泛的研究。

在本研究中，我们从深海酵母N6菌株中克隆并鉴定了Cu/ZnSOD基因(Cl-SOD1)。此外，通过在酿酒酵母sod1突变体中的表达，分析了Cl-SOD1蛋白的功能特性。结果表明，Cl-SOD1的比活性是Sc-SOD1的比活性的约四倍。

材料和方法

菌株，质粒和培养基

大肠杆菌 DH5alpha;，质粒pUC19和pBluescriptIISK（ ）（Stratagene）分别用作DNA操作的宿主和载体。液化酵母菌株N6来自日本海沟采集的样品（Abe等人，2001年）。酿酒酵母 INVScl（MATalpha;，his3-Delta;1，leu2，trp1-289，ura3-52）（Invitrogen公司），含有酿酒酵母醇脱氢酶基因启动子的pAUR123质粒（TakaraBio公司）和酿酒酵母TRP1基因和ARS1片段的PUC-AT（Kajiwara 2002），用于构建表达基因的酵母菌株。酿酒酵母 S288C（Kajiwara 2002）和pJJ242（Jones和Prakash 1990）分别用于分离酿酒酵母SOD1和URA3基因。通过Hoffman和Winston（1987）的方法提取酵母DNA。酵母细胞在YPD培养基（1％w/vBacto酵母提取物，2％w/vBacto蛋白ept，2％w/v葡萄糖）或完全微量滴滤培养基（CM培养基）中生长，如Ausubel等人（2002年）所述。除非另有说明。

从菌株N6分离同源基因片段以制备Cl-SOD1特异性探针

操纵大肠杆菌和酵母DNA按照标准程序进行（Ausubel等人资料编号：[416539]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word

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