力学刺激对TDSCs在 P(LLA-CL)-Col构建的组织工 程肌腱支架中成熟的影响外文翻译资料

 2022-09-27 11:09

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力学刺激对TDSCs在 P(LLA-CL)-Col构建的组织工

程肌腱支架中成熟的影响

摘要

力学刺激在肌腱的发育和再生中扮演了重要角色，肌腱干细胞（TDSCs）是肌腱损伤修复及组织工程肌腱构建的一个有力的种子细胞来源。然而，这些细胞在肌腱组织工程中的应用尚未被充分探索，对TDSCs支架构建的组织工程肌腱的成熟中机械刺激的影响还缺乏理解与认识。在本研究中，我们对在体外和体内的TDSCs在聚(L-lactide-co-ε-caprolactone)/胶原蛋白(P(LLACL)/Col)构建的支架下的效率进行评估，以及评估TDSCs支架构建的转移的效用，以促进兔子膝肌腱损伤的再生。TDSCs表出现了良好的增殖和肌腱关联的细胞外基质（ECM）在体外机械刺激下基因和蛋白质的表达。移植到裸鼠后，荧光成像表明TDSCs长期稳定存在，并在宏观评价、组织学和免疫组织化学检查中显示出高质量的新肌腱在体外机械刺激下形成。此外，在一个兔子的膝肌腱损伤模型中，组织学，免疫组织化学，胶原蛋白含量测定和生物力学测试数据均表明，动态培养的TDSCs支架构建可以显著的促进肌腱的再生。TDSCs 作为种子细胞在损伤肌腱再生中有巨大的应用潜能，它可以通过将TDSCs播种到一个P（LLA-CL）/Col中然后给予机械刺激而成功伪造支架。

1 介绍

2 材料和方法

2.1 支架的制备

本研究中纳米支架是根据先前的文献报道应用一个动态水流系统通过静电纺丝法制作而成的。简言之，就是在一个水盆底部打一个 8 mm 直径的洞产生水涡流，在水通过该孔排入盆下面的水槽后，利用泵回收水从而保持稳定的水量。P(LLA-CL) 和胶原溶解在 HFIP 中，形成 90：10 的混合液(8 w/v %)，该混合液在水涡流上方 15 cm处在 15 kv 电压条件下以 1.0 m L/h 的速度喷射。当 HFIP 蒸发后，就形成静电纺纳米纤维，它堆积在水面，在水涡流作用下，纳米纤维成束形成纳米纱，再通过一个旋转轴(60 r/min)收集在一起形成纳米纱支架。获得的支架-80℃冻存 2 小时，然后过夜冻干。最终获得的取向的纳米纱支架大约有150 micro;m 厚，保存在真空罐中。大体形态和扫描电镜 (SEM) (Hitachi S-3000N) 图像(图4-2 B)揭示支架的形态都与先前的研究结果一致。

2.2 细胞分离和培养

动物实验由第三军医大学动物保护和利用委员会(IACUC)批准。原代 TDSCs 从日本大白兔双侧髌腱收获的，根据先前描述的方[1,2]，然后重悬在含 20%胎牛血清，1%青霉素和链霉素的 DMEM/F12(1:1)培养基中。所得细胞悬浮液稀释后获得 1 细胞/micro;l的单细胞悬液，滴加到 96 孔板在 37℃和 5%的 CO2孵箱中培养 8-10 天，直到 TDSCs克隆形成。单个细胞克隆在显微镜下局部应用胰蛋白酶分离，收集单克隆的 TDSCs用微吸管转入 T25 的培养瓶进一步培养。培养液每三天更换一次，细胞达到 90%的融合后用 0.25%胰酶消化传代。具体方法参考前面 2.3.1。

2.3 体外实验研究

2.3.1静置和张应力刺激培养

TDSCs-支架复合物支架样品(长度times;宽度3times;2.5 厘米)被放置在 6 孔板中，用 70%乙醇消毒 30 分钟，然后用无菌 PBS 漂洗 3 次，每次 5min，随后浸入 DMEM/F12 培养基中过夜 TDSCs(第三代)(图 4-2 A)接种在支架上(1times;105细胞/支架)。细胞支架复合物放置在 37℃，5%的CO2的孵箱中培养 4h，以促进细胞的粘附。然后，6 孔板中加入适量培养基，每两天换液一次。 细胞支架复合物(图 4-2 C)静置培养 24h 后，沿着支架的 3 厘米长轴卷成同心的 3D结构，然后，在无菌条件下用尼龙线固定在组织培养室的两个相对的固定柱上(图 4-2 D，绿色箭头)。3 个细胞支架复合物/培养室。每个培养室入约 80ml 培养液。力学刺激培养运用我们课题组前期研制的力学牵拉刺激系统[3]。应力刺激组：参照先前的报道[4]给予细胞支架复合物 4%幅度，0.5 Hz，2h/天的循环张应力刺激。 静置组：在培养室中静置培养细胞支架复合物。样本培养 14 天，一周换液两次。

2.3.2 细胞活性和形态

细胞的活性和形态用 Live/Dead 染色剂根据制造商的说明进行评估[5]。 操作步骤如下： (1) 将检测时间点(1d；7d；14d)的样本从培养室中取出，修剪成 0.5 cmtimes;0.5 cm 大小，PBS 漂洗两次； (2) 将样本转移至 24 孔板中，加入 PBS，2 ml/孔； (3) 加入 4 ul B 液溶于其中； (4) 再加入 1 ul A 液溶于其中，轻轻混匀； (5) 避光，37℃，5%的 CO2的孵箱中培养 15min； (6) 吸掉工作液，PBS 漂洗一次； (7) 染色的样本使用激光共聚焦显微镜观察，绿色显示活细胞，在最佳激发波长和最大发射波长 495/515 nm 处成像；红色显示死细胞，在最佳激发波长和最大发射波长495/635 nm 处成像； (8) 用图像分析软件分别 Image J 1.46 r 对所得的图像进行分析，计算活细胞数和总的细胞数，并计算它们的比例(n=3)。

2.3.3 细胞增殖

总 DNA 的含量通过 Pico Green ds DNA 分析试剂盒来评估[1]，取所收获的样本用0.1%的 Triton-X (Sigma)处理后，用 5w 的超声波破碎 20s。荧光在激发/发射波长为485/535 nm 处使用酶标仪的检测，用 DNA 浓度关联的荧光强度绘制一个标准曲线，计算样本中细胞的数量。

2.3.4 组织学分析

收获不同时间点培养好的组织工程肌腱标本，固定于 10%中性福尔马林中，然后酒精梯度脱水，石蜡包埋。沿着纵向部分(5 micro;m)切片，进行苏木精和伊红(H amp; E)染色，评估细胞的生长及渗透情况。具体方法参考前面 3.3.6。

2.3.5 实时定量 PCR 分析

为了确定周期性张应力刺激对 TDSCs 的分化的影响，我们对动态和静态组培养了7 天和 14 天的 TDSCs 的成肌腱(type I collagen, type III collagen, scleraxis, decorin, biglycan and tenascin-C)，和成骨(Runx2)成软骨(Type II Collagen, Aggrecan)分化标记的m RNA 分别进行了检测，(接种前的 TDSCs 作为对照)。用 TRIzol 提取试剂盒根据其说明提取总 RNA。取 500 ng 的 RNA，用 RR047A 反转录试剂盒配制 20u L 的反应体系，参照制造商的说明进行逆转录反应。实时定量 PCR 采用 2times; SYBRreg; Green PCR Master Mix 在 Applied Biosystems 7500 实时定量 PCR 仪上进行。所有的引物序列(表4-1)由 primer 5.0 软件设计并由上海生工公司合成。每个样本重复检测三次，每个基因检测三个 PCR 循环。b-actin 作为内参基因，目的基因的表达水平用 2-△△Ct公式计算获得

3.3.6 Western Blot分析

(1) 按照试剂盒说明配制 12%( 26 k Da Tenascin-c)和 10%的(136 k Da type I collagen, and 160 k Da type III collagen) SDS-PAGE 分离胶； (2) 配制 5%的 SDS-PAGE 浓缩胶； (3) 擦净玻璃板，对齐后放入夹中夹紧，垂直卡在架子上； (4) 各组分混匀后，灌下层分离胶，正丁醇封闭，等 20-30min 后灌上层浓缩胶，立即插入梳子； (5) 10-20min 后取出梳子，组装电泳装置，在两玻璃板中加新鲜电泳液，电泳液要漫过内侧玻璃板，玻璃板外加入回收电泳液； (6) 样品处理，取适量蛋白样品(根据蛋白浓度计算上样量，加等体积 2 times; SDS loading Buffer 100℃煮 3-5min)上样，第一个孔上 marker，余空白孔加适量 2 times; SDS loading Buffer 稀释到 1times;压带； (7) 电泳 30V 先跑 5min，80V 跑完浓缩胶，120V 跑完分离胶(一般出现 marker后再改成 120V)，电泳一般 1.5-2h，跑到距离底部 0.5 mm 时关闭电源； (8) 电泳结束后，将电转液倒入 2.5L 平底托盘中，将滤纸和海绵垫浸于电转液，将 PVDF 膜修剪到适当大小，用无水甲醇浸泡 5-10s，取出后浸入电转液中 5min，根据目的条带大小切胶，平放于 PVDF 膜上，对齐后铺上滤纸，夹好夹子，注意正确顺序，放在冰盆中转膜 100V，1.5-2h； (9) 电转后用 5% BSA 泡 PVDF 膜，室温封闭 2h； (10) TBST 洗膜三次，每次 10min； (11) 加入单克隆抗体 collagen I(1:1000), collagen III (1:250), tenascin C (1:500) 和GAPDH (1：5000) 4℃孵育过夜； (12) 转至室温放置 30min，TBST 洗膜三次，每次 10min； (13) 加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗(1:2000)，摇床孵育 2h； (14) TBST 洗膜三次，每次 10min； (15) 将膜放入蜡盒中，加入配制好的超敏显色液，室温显色，激光扫描仪器扫描。蛋白的表达水平通过 Image J 软件来测定条带的光密度，以 GAPDH 条带为内参(n=3)。

2.4裸鼠体内异位移植 TDSCs-支架复合物

2.4.1 细胞标记和异位移植组织工程肌腱

TDSCs 应用于体内异位移植研究前先用 CM- Dil 预染色[1]。步骤如下： (1) 取培养好的 TDSCs，用胰酶消化后制备 1times;107/ml 的细胞悬液； (2) 加入配制好的 2 ug/ml CM- Dil 在 37 ℃孵育 5min； (3) 再转至 4℃孵育 15min； (4) 1000rpm 离心 5min，弃上清；PBS 漂洗 1 次，1000rpm 离心 5min，弃上清； (5) 新鲜培养基重悬细胞，接着按先前的方法将细胞接种到支架上 (5 cmtimes;2.5 cm, 5 times; 105 cells/支架)。 参照先前文献的报道[2]，使用裸鼠模型检测在体内力学刺激下 TDSCs-支架复合物形成肌腱的潜力(图 4-2 E)。 (1) 简单的，总共 15 只裸鼠，用 0.05%戊巴比妥钠 0.3ml/只腹腔注射麻醉； (2) 将麻醉好的裸鼠固定在试验台上，铺无菌单，在其背部正中切开 2 厘米的皮肤切口； (3) 取总长为 4.5cm 的组织工程肌腱，沿其长轴卷成圆柱状； (4) 分离裸鼠背下胸 12 至腰 1 椎部位，将组织工程肌腱一侧的 2cm 两端用 6-0 尼龙缝线缝合在裸鼠背部韧带上，拟使老鼠在自然运动时对组织工程化肌腱提供应力刺激，剩余的组织工程肌腱 (约 2 cm) 埋植在皮下作为对照； (5) 缝合皮肤创口，消毒，待手术后裸鼠苏醒后放回笼中继续饲养，术后 2，4 和8 周行体内荧光检测，然后收集移植组织性 HE，masson 和免疫组化检测。

2.4.2 大体观察及体内活体成像

新生肌腱组织在各个时间点的荧光成像参照先前的文献[3]由 IVIS 200 活体成像仪检测完成。每只裸鼠用 0.3ml 0.05%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后立即放置在 IVIS 200

2.4.3 组织学和免疫组化检测

新生的肌腱组织 HE 染色参照前述方法。除此之外，根据 Masson 试剂盒说明方法检测胶原的形成情况。步骤如下： (1) 取前述步骤中的切片脱蜡至水化； (2) 滴加 1 滴 Masson 复合染色液染色 5min，蒸馏水稍洗； (3) 滴加 1 滴磷钼酸染色 5min，甩干； (4) 直接滴加 1 滴苯胺蓝染色 5min，蒸馏水稍洗； (5) 滴加 1 滴分化液分化 30～60s(2 次)； (6) 95%酒精脱水多次。无水酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封固； (7) 光镜观察。 为了分析新生肌腱的肌腱相关蛋白表达水平，进行免疫组化染色[1]。 (1) 将前述步骤获得的切片，脱蜡：切片室温中放置 60min，然后二甲苯(Ⅰ)、(Ⅱ)浸泡，共 25min； (2) 再水化：无水酒精(Ⅰ)、(Ⅱ)、95%、80%、70%酒精(Ⅰ)、(Ⅱ)各 2min； (3) 阻断：3% H2O2 去离子水孵育 10min，以灭活内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗 3 次，每次 5min； (4) 抗原修复：置 0.01M 枸橼酸缓冲液(PH 6.0)中用煮沸(95℃，15-20min)，自然冷却 20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS 冲洗 3 次，每次 5min； (5) 封闭：滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育 20min，甩去多余液体； (6) 滴加稀释的一抗，单克隆抗体 collagen I(1:1000)， collagen III (1:250)， tenascin C (1:500) 和 GAPDH (1：5000) 4℃孵育过夜，PBS 冲洗 3 次，每次 5min； (7) 滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗(1:2000)，室温孵育 1h，PBS 冲洗 3 次，每次 5min； (8) 滴加 SP(链霉亲和素-过氧化物酶)室温孵育 20min，PBS 冲洗 4 次，每次 5min； (9) 显色：DAB 显色 2-5min，PBS 冲

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