拟南芥中原核生物的UMP（单磷酸尿苷）激酶相似物参与psaA/B的转录调控外文翻译资料

 2023-01-06 11:01

拟南芥中原核生物的UMP（单磷酸尿苷）激酶相似物参与psaA/B的转录调控

Paul Hein,Jana Stouml;ckel, Stefan Bennewitz ,Ralf Oelmuuml; ller

摘要：Dpt1是拟南芥中一个新型的光系统突变体，dpt1突变体无法进行光能自养和完成psaA/B的转录表达，而剩余的转录水平PSI子单元,PSII的子单元，the cyt-b6/f-complex和（核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶）the ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase属于野生型。用活体器官进行的转录分析表明，在dpt1-1突变体中较低的psaA / B转录丰度，不是因为psaA / psaB / rps14操纵子的转录能力不足。突变体中，psaA/B 转录物与多核糖体及翻译有关。因此，在dpt1突变体中，特异影响psaA / B转录后加工过程。dpt1基因是通过图位克隆方法分离出来的，它的蛋白质位于叶绿体基质中，与原核生物的UMP激酶表现出惊人的相似度。我们的研究结果表明核编码的蛋白质Dpt1对高等植物叶绿体的光合活动至关重要，且参与psaA/B转录后修饰。我们推测Dpt1可能是一个双功能蛋白，连接嘧啶代谢和光合作用的电子传递。

关键字：拟南芥，叶绿体，基因表达，光和系统I，图位克隆

前言：光系统(PS) I是一种进化上保守的复合蛋白体，位于蓝藻的类囊体膜和绿藻以及高等植物的叶绿体上。PS I具有质体蓝蛋白，铁氧还蛋白，氧化还原酶等蛋白的功能(Chitnis 2001)。2003年， PSI的第一个晶体结构是在高等植物中发现的，由4.4A °原理决定的(Ben-Shem et al. 2003)。植物的PSI结构为单体，不同于蓝藻PSI的三聚体结构(Chitnis 2001; Jordan et al.2001)。PSI复合体由一个反应中心和相关的集光叶绿素复合体组成(LHCI). 至少15个不同多肽亚基(PsaA-L和PsaN-P)与高等植物的PSI系统有关(Jensen et al.2007)。在真核生物中，五种多肽 PsaA-C，PsaI和PsaJ由质体基因组编码，剩余的由核基因编码 (Shinozaki et al. 1986；Hayashida et al. 1987;Sugiura 2003)。 PsaA ，PsaB是最大的两个多肽，每个单元有11个跨膜螺旋，形成异质二聚体，连接初级电子供体P700，电子受体有A0(叶绿素分子)，A1（维生素k1)，Fx ([4 fe-4s]集群)和大部分的剩余的PSI-辅酶因子包括叶绿素a和beta;-胡萝卜素 (Chitnis 2001)。两个末端辅酶因子FA和FB是[4 Fe-4S]集群在复合体的基质位点，由PsaC 连接(Chitnis 2001)。集光叶绿素复合体由叶绿素、类胡萝卜素、补光叶绿素结合蛋白组成，主要捕捉大部分的光能量。在拟南芥中已确定六个LHCPs的基因(reviewed in Jensen et al. 2007)， 且至少有一个单拷贝，Lhca1-4存在于PSI-LHCI复合体中(Ben-Shem et al . 2003;Ballottari et al . 2004年)。

PSI生源论取决于适当的形成异质二聚体的PsaA / B。一些标准蛋白质被PSI的生物起源所利用，特别是某些二聚体在高等植物中已确定。有研究表明，Ycf3连接PsaA和PsaD(Naver et al . 2001年)还参与核心组分的装配(Ruf et al. 1997)。Pyg7编码一个TPR 蛋白，可被PSI装配和复合体共纯化 (Stouml;ckel et al . 2006年)。AtCnfU-V和AtCnfU-IVb 是拟南芥NifU-like叶绿体小分子热激蛋白，AtCnfU已被证明作为叶绿体铁硫蛋白的支架蛋白集群，也被铁氧还蛋白和PSI的生物起源所利用(Yabe et al . 2004年)。拟南芥突变体缺乏Hcf101，它能够合成PSI子单元,但不能组装一个稳定的PSI复合体(Lezhneva et al . 2004; Stouml;ckel and Oelmuuml; ller 2004)。apo1突变体缺乏PSI核心单元，它被认为可为[4Fe–4S]群的生物合成提供配体(Amann et al. 2004)。最后，Atab2被发现是RNA结合蛋白，它可激活细胞质基因编码的PSI、PSII子单元的翻译 (Barneche et al . 2006年)。

PSI系统的形成，特别是psaA / B的表达在高等植物中是高度有序的。比如，PSI、PSII反应的数量，可用一种互补的方式改变光质量，这可优先激发每个光系统，这与psaA / B和psbA的表达率改变密切相关(Pfannschmidt et al . 1999年)。此外，线粒体电子传递链的特定的信号通路的紊乱和PSI mRNAs的表达下调削弱叶绿体中PSI系统形成。细胞核和细胞质中编码PSI的基因的下调包括那些来自psaA/B操纵子的基因表明可能与复合体的信号转导途径有关(Jiao et al. 2005)。

迄今为止许多调控蛋白参与转录后翻译和PSI系统的装配，这已被发现，它极大地拓展了我们对它的生源论的理解。我们对蛋白质的认识来自于对高等植物转录后成熟和psaA / B的表达，但这仍然是有限的。在这里，我们研究dpt1（psaA/B转录表达的缺陷）的特性，一种拟南芥的新型的PSI 突变体。由于psaA / B转录产物的积累，dpt1突变体是致死的苗。Dpt1是核编码的光诱导质体蛋白，与原核生物的UMP（单磷酸尿苷）激酶的相关蛋白质具有很高的相似之处。我们研究到， Dpt1控制 psaA / B的表达具有潜在可能性。比较Dpt1与其他调控蛋白在细胞器和细菌发现了意想不到的相似性。

材料和方法

植物材料和生长

拟南芥幼苗生长在22°C条件下，连续的100 lmol m-2 s-1 的光照处理。种子用33%(v / v)漂白剂和0.08% N-laurylsarcosinate杀菌，再用1毫升无菌水洗5次,放置在含1.35%(w / v)蔗糖的Murashige和Skoog（1962)培养皿中。第一个48 h时,种子放在4°C，遮光处理。18天后，收获幼苗或转移到土壤培养。其他的培养方法在文本表示。dpt1-1是一个化学诱导甲烷磺酸乙酯(EMS)突变体。dpt1-2是T-DNA插入序列插入一行(N829192)从 the Nottingham Arabidopsis Stock Centre, Great Britain获得(Alonso et al. 2003)。对dpt1-2分离分析，引物是5，-AGGGTTTAAAATGAGCTTCAT-3，和5，-TCTTTCGTGGATCTACCTGGG-3，。T-DNA插入到At3g18680第5个外显子(在ATG的下游1304nt处)。照明实验,拟南芥幼苗在光照强度100 umol m-2 s-1 生长10天,然后遮光处理4天, 再在不遮光的情况下100 umol m-2 s-1处理1天。

叶绿素测量

叶绿素浓度已经确定(Porra et al. 1989)

叶绿素荧光分析技术

生长18天的拟南芥幼苗进行体内叶绿素测量，运用叶绿素荧光成像Fluorcam 700MF(Photon System Instruments, Brno, Czech Republic)。使用下面的程序：10分钟暗适应，3 s测量Fo，光脉冲3000 umol m-2 s-1持续1600ms来确定Fm，光化10min确定Ft，遮光处理2分钟，确定Fo，。

低温k荧光发射光谱测量

低温k荧光发射光谱在440 nm激发后记录600 - 800 nm的测量值,使用Hitachi F-3000荧光分光光度计。拟南芥幼苗平均分配在0.33M梨糖醇， 50Mm HEPES-KOH pH值为8.0，1 mM MgCl2，2 mM EDTA中，叶绿素浓度调整到1ug /ml。

P700吸光度变化

在体内光诱导P700吸收率在810nm发生变化，使用PAM101荧光仪连接到双波长发射/接收单元（EDP700DW，Heinz Walz GmbH)。远红光（730 nm，15 W m-2）由远红外二极管发射，（102-FR,Heinz Walz, see above)持续1分钟，应用于P700氧化。30秒的远红光后，一个强烈的白光脉冲6000 umolL m-2 s-1进行，最大值为800 ms. 最大信号(Delta;A810max)和P700的氧化状态的差异被用来估计PSI的光化学系统容量。(Barth and Krause 2002)。

Northern 印迹分析

RNA分离纯化和Northern 印迹分析运用根据Heim et al.(1993)。野生型植株和突变体植物取15 ug的提取总RNA。标明稀释度。以下引物可作为探针：

杂交探针用32P dCTP标记，使用任意Amersham Biosciences (Buckinghamshire，UK)引物标记系统。

引物扩增分析

根据Fey et al. (2005)引物扩增。

抗血清和引物印迹分析

免疫印迹分析，叶片材料用液氮处理，重悬于缓冲液中(50 mM Tris–HCl， pH 8. 0， 10 mM EDTA， 2 mM EGTA，和 10 mM DTE)。17000g离心10分钟，溶性蛋白质用柠檬酸（TCA）沉淀使最终浓度15%，重悬于缓冲液中(100mM Na2CO3 ，50 mM 糖醇和10%蔗糖)。膜蛋白重悬在缓冲液中。当使用总蛋白提取时，分离方法正如Ensminger et al. (2004)描述。

Anti-Dpt1抗体不同于多肽N-CPRLPSFDGTSKPPL-C和N-CSEPGNIAKAIKGER-C，分别与对应的氨基酸残基81 - 94和309 – 322相似(Agrisera, Sweden)。亲和纯化抗体的1:1,000稀释液用于免疫印迹分析，所有其它抗体前面已描述(Stouml;ckel and Oelmuuml;ller 2004； Stouml;ckel et al. 2006)。Anti-PsbB抗体从Agrisera获得。

定位克隆dpt1-1

选择哥伦比亚(Col)背景杂合突变体植株dpt1-1花粉供体与兰茨贝格雌性受体植物然后自交产生F1代。拟南芥染色体的一个突变位点确定运用30 F2植物纯合子突变dpt1以及简单的组合序列长度多态性(SSLP)(nga248 nga280,nga111、nga168 nga162、nga6 nga8 nga151,nga76; Bell and Ecker 1994)和裂解放大多态序列(CAPS)标记(PhyB and AG; c.f. http://www.Arabidopsis.org)，用高分辨率基因组映射分离

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