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模拟酸雨和氯化镧对水稻叶绿体结构和功能元件的综合影响
摘要
酸雨和稀土元素（REE）污染在许多农业地区同时存在。然而，REE的含量分配和如何影响酸雨的作用还有很多都是未知的。因此，进行模拟酸雨和氯化镧（LaCl3）对叶绿体形态，叶绿体超微结构，功能元素的含量，叶绿素含量和净光合作用的综合影响的实验。通过模拟酸雨和稀土污染，研究了水稻（Oryza sativa）的净光合速率（P n）。在pH4.5和0.08mM LaCl3的模拟酸雨的联合处理下，叶绿体膜光滑，膜上的蛋白质均匀，叶绿体结构整合，类囊体有序排列，模拟酸雨和LaCl3的结果显示为轻度拮抗作用；在联合处理下，Mg，Ca，Mn含量，叶绿素含量和P n增加，也具有模拟酸雨和LaCl3的协同效应。在模拟酸雨和LaCl3的其它组合处理下，叶绿体膜表面不均匀，在叶绿体表面观察到清晰的B孔，类囊体松散并分解，并且功能元素（P，Mg，K，Ca，Mn，Fe，Ni，Cu，Zn和Mo）和叶绿素含量降低。在这些组合处理下，模拟酸雨和LaCl3表现出协同效应。基于上述结果，建立了模拟酸雨和LaCl3对植物光合作用的综合影响的模型，以揭示对植物光合作用，特别是对光合细胞器中叶绿体的综合作用。实验结果将会为进一步了解模拟酸雨和LaCl3植物光合作用的联合效应的机制提供一些参考。
关键词 模拟酸雨；镧；叶绿素结构；功能元素；组合污染
引言
酸雨是世界上最严重的环境问题之一（Wang et al。2013; Wang et al.2014a）。最近，由于工业发展迅速和普遍，大气中的二氧化硫和氮氧化物逐渐增加，酸雨的范围和程度逐渐扩大（Imran et al.2014），对植物造成严重影响（Ruuhola et al. 2009；Dias等.2010）。 许多研究表明，当酸雨的pH值超过植物的耐受极限时，叶片会变黄并脱落，出现坏死，植株开始老化等。（Wang et al.2011; Wang et al.2012a）。最近的研究还表明，酸雨对植物光合作用产生有害影响。发现在pH3.0的酸雨降低大豆幼苗中Hill反应活性以及叶绿素含量和光合速率（Sunetal.2012）。此外，当用pH 3.5或2.5的酸雨处理水稻时，净光合速率（P n），气孔导度，细胞间CO 2浓度，表观量子产率和羧基化效率降低（Wang等2014）。还观察到在pH2.5的酸雨处理对叶绿素含量和黄瓜的最大光系统II（PSII）光化学效率有显著影响（Yin等人，2010）。此外，pH 4.5或更低的酸性破坏了大豆幼苗的叶绿体结构：更薄的颗粒类囊体和更松散的类囊体层状结构，导致光合作用受到抑制（Wen等人2011）。这些研究表明，酸雨可以显著影响植物中叶绿体的超微结构和功能，从而减少光合作用。稀土元素（REE）是具有类似物理和化学性质的一系列元素，广泛用于制药，化学，农业，电子，新材料和航天工业（Redling2006）。由于REE的广泛开发，生产和应用，这些元素在环境中大量积累（Hu et al.2006;Schuuml;leretal.2011）。在0.666 mM氯化镧（LaCl3）处理下，光化学猝灭和光系统II的有效量子产率显着降低（Zhou et al.2011）。此外，用1224.5和2449.0mu;M的LaCl3处理降低了水稻中的Pn，Hill反应速率、量子产率和羧化效率（Wang等2014）。据报道，REE首先以纳米级颗粒的形式锚定在质膜上，然后通过内吞作用进入细胞，从而影响植物的正常光合作用（Wang等2014）。当用1.20mM LaCl3处理大豆幼苗时，它们的颗粒类囊体变薄，类囊体的层状结构变松散（Wen等2011）。
有趣的是，酸雨和稀土元素污染同时存在于许多农业地区。这两个环境因素的结合可以影响植物的生长和发育，最终影响农业生态系统的安全（Sunetal.2013; Wang等，2014）。 相对于关于酸雨或REEs单独对植物的影响的大量文献，已经发表的关于酸雨和REE联合对植物光合作用的影响的研究还较少（Wen等2011; Wang等2014a）。
水稻是世界上最重要的粮食作物之一。光合作用是水稻有机质积累的重要生理和生化过程，代表了水稻产量的生理基础（Taiz和Zeiger 2010）。在我们以前的研究中发现酸雨和LaCl3的组合在安全水平下会严重损伤水稻光合作用（Wangetal.2014a）。此前公开的，对酸雨和稀土元素的潜在环境风险进行科学评估，且成功评估的准确性取决于单一或联合污染因素的使用。然而，酸雨和LaCl3对水稻光合作用的综合影响仍然不确定。叶绿体是植物光合作用的细胞位点，其与叶绿体结构的完整性密切相关（Taiz和Zeiger 2010）。因此，本研究中，研究了模拟酸雨和LaCl3对稻叶中叶绿体结构和功能元素的综合影响。使用相关的测试指数的统计分析，从细胞和分子水平的环境生态学的角度阐明了组合的作用和作用机制。该研究为进一步了解模拟酸雨和LaCl3对植物光合作用的综合效应机理，科学评价农业环境中酸雨和稀土元素联合污染的潜在环境风险提供了一些参考。
材料和方法
制备水稻营养液、LaCl3溶液和模拟酸雨
根据国际水稻研究所（IRRI）（Yoshida等，1976）发布的离子组成制备改性水稻营养液。全强度改性营养液具有以下组成：1.43mM NH 4 NO 3，0.51mM K 2SO 4，1.00mM CaCl 2，1.64mM MgSO 4，9.47mu;MMnCl 2，0.075mu;M（NH 4）6 Mo 7 O24,
19.00mu;MH 3 BO 4，0.15mu;MZnSO 4，0.16mu;MCuSO 4，36.00mu;MFeCl 3和77.42mu;M柠檬酸。在营养液中以NaI·3·9H 2 O的形式提供1.67mM的SiO 2。通过使用PHS-29A pH计（上海安亭科学仪器厂，中国上海）将营养液pH调节至5.5。
通过向去离子水中加入Ca 2 ，Na ，K ，NH 4 ，Mg 2 ，SO 4 2-，NO 3 - ，F - 和Cl - 制备pH为7.0的对照降雨，其中Ca 2 ，Na ，K ，NH 4 ，Mg 2 ，SO 4 2-，NO 3 - ，F - 和Cl - 含量分别为0.83mu;M，1.32mu;M，0.15mu;M，5.34mu;M，0.36mu;M ，0.64mu;M，0.47mu;M，0.69mu;M和1.80mu;M。离子组成来源于中国东南部的降水资料（Kong et al. 2012; Xie et al. 2012）。
根据中国土壤中稀土元素的当前含量和酸雨的pH值，分别为0.08,1.20和2.40 mM的LaCl 3（分别为低，中和高浓度）和pH4.5,3.5和2.5的模拟酸(低，中和高酸度）。通过将适量的氯化镧六水合物（LaCl3·6H2O，Sigma-Aldrich，USA）溶解在不含磷酸盐的改进的营养液中来制备LaCl3溶液（0.08,1.20和2.40mM）。在pH值为4.5，3.5和2.5的模拟酸雨通过以1.1:1（v / v，化学当量）的比例加入浓H2SO4和HNO 3调节对照雨的pH来制备）（Kong et al. 2012; Xie et al. 2012）。
植物培养和处理
称量经空气干燥的基质（蛭石和珍珠岩，1:1，v / v），并向每个罐（直径= 15cm，高度= 30cm）中精确地加入1.0kg。向每个罐中加入LaCl 3溶液（Sigma-Aldrich，USA）（0.08,1.20和2.40mM）。在将底物彻底混合并平衡2周，加入改性的水稻营养液以保持水含量约60％。将不用和用LaCl3处理的基材分别用作对照基材和LaCl3基材。
将水稻种子在HgCl2（0.1％）溶液中表面灭菌10分钟，并用去离子水漂洗几次。将无菌种子放置在铺有三层湿润纱布的培养皿中，并在培养箱中发芽2天。将发芽的种子播种在无菌砂床中。在两片叶子的阶段，将均匀的健康植物移植到填充有对照底物或LaCl3底物的罐中。将其放置在25plusmn;3℃的温室中，光强度为1000mu;molm -2 s -1，日/夜周期为16/8小时，相对湿度为70-80％。改性水稻营养溶液用于灌溉植物并保持底物的水含量约60％。同时，每3天喷洒水稻植物，每盆300mL模拟酸雨，对照植物用对照雨在pH7.0喷雾。根据中国东南部的降水和蒸发量计算模拟酸雨和对照降雨的喷雾量。此外，每3天提供改良的营养液。所有处理以六次重复进行，并且每隔一天将1mM KH2PO4喷在叶子上,作物植物所需的无机磷酸盐。在分蘖阶段（酸雨喷洒后35天），对用或不用LaCl3处理的新鲜叶子和模拟酸雨进行取样用于分析。
测量P n
通过使用便携式光合系统（CIRAS-1，PP Systems International Ltd.，UK）在水稻的25plusmn;5℃，320mu;L-1 CO 2和80％CO 2的培养条件下测量P n（相对湿度）。通过CIRAS-1光合作用系统的钨 - 卤素灯叶片提供1000mu;molm -2 s -1的光合有效光子通量密度。
叶绿素含量的测定
将稻叶浸泡在80％丙酮中，然后提取叶绿素。 将提取物在5300g离心10分钟。 然后在645和663nm读取上清液的吸光度。 根据以下等式计算总叶绿素，叶绿素a（Chla）和叶绿素b（Chlb）含量：20.2A 645 8.02A 663,12.7A 663 -2.68A 645和22.9A 645 -4.68A 663（Lichtenthaler 1987）。
TEM观察叶绿体超微结构
根据先前的方法进行叶绿体超微结构的TEM观察（Helliot等人，2003）。将新鲜叶切成1.5times;2mm。 用3.5％戊二醛固定24小时后，用1％锇酸在4℃下将叶细胞后固定4小时，然后用乙醇脱水。 将样品嵌入新制备的100％Epon-812中，并在80℃下聚合24小时。 对于超微结构观察，将获得的样品在LKB超薄切片机上切成超薄切片（〜60nm）。 然后，在250目网格上挑取超薄切片，并用乙酸双氧铀和铅进行后染色 最后，用TEM（H-600-A-2，Hitachi Ltd.Japan）获得TEM图。
AFM观察叶绿体形态结构
将水稻叶（1.5g）在含有0.30M山梨醇，0.05MHEPES-KOH，0.01M KCl，2.00mM EDTA，1.00mM MnCl2，0.08mM K 2 HPO4和1.00mMMgCl2的叶绿体提取缓冲液的混合器中匀浆。然后通过四层纱布过滤并在510g和4℃下离心5分钟。通过在1800g和4℃下离心5分钟从上清液中分离完整的叶绿体。
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