藏花素和紫杉醇或藏红花素与辐射的协同凋亡作用对MCF-7细胞，乳腺癌细胞系的类型外文翻译资料

 2022-05-01 21:42:44

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研究文章

藏花素和紫杉醇或藏红花素与辐射的协同凋亡作用对MCF-7细胞，乳腺癌细胞系的类型

Faeze Vali,1 Vahid Changizi,1 and Majid Safa2

德黑兰医科大学附属医学院放射和放疗科技术部，伊朗德黑兰Keshavarz大道22号，14177-44361

伊朗德黑兰伊朗医科大学医学院2

函件应寄给Vahid Changizi; changizi@sina.tums.ac.ir收到2015年9月7日; 2015年11月4日修订; 2015年11月11日接受学术编辑：Claudio Luparello

版权copy;2015 Faeze Vali et al。 这是一个开放获取的文章，根据知识共享署名许可证分发，允许在任何媒体上无限制地使用，分发和复制，前提是原创作品被正确引用。

背景。化疗，放疗和手术是乳腺癌的常规治疗。但是，这些方法只能改善生存。目前，包括hercin在内的综合疗法如crocin正在研究改善乳腺癌治疗。本研究的目的是评估crocin，紫杉醇和放射对MCF-7细胞的影响。方法。为了评估crocin，紫杉醇和辐射对MCF-7细胞存活率的影响，进行MTT测定。为了研究实验组的凋亡效应，使用PI流式细胞术，并且通过蛋白质印迹研究凋亡蛋白质（胱天蛋白酶-7，胱天蛋白酶-9，PARP和p53）的表达。结果。这项研究表明，0.01mu;mol/ mL紫杉醇和2.5 mg / mL crocin联合治疗48小时后，可能对MCF-7细胞系产生IC50。本研究表明，2 Gy伽马射线联合Crocin联合治疗可将MCF-7细胞系的凋亡从21％（与单独使用2 Gy伽马射线相关）升高至46.6％。结论。 Crocin和紫杉醇以及crocin和gamma;辐射对MCF-7细胞系具有协同作用以获得更显着的细胞凋亡

1.介绍

乳腺癌是世界上妇女中最常见的恶性肿瘤[1]。由于近年来全球失控的增长，这一点非常重要。在美国，每八名妇女中就有一名妇女面临这种疾病。仅在2013年，该癌症社会中又增加了约230,000名女性和2000名男性[2]。虽然亚洲的癌症发病率较低，但其死亡人数高于西方国家。在伊朗，乳腺癌在女性恶性肿瘤中发病率最高。已经发现伊朗的乳腺癌发病率低于发达国家。然而，这种疾病是伊朗女性中最常见的癌症。在过去的二十年中，这种恶性肿瘤的发病率有所增加[3]。

放疗，化疗和手术是乳腺癌常用的治疗方法。大多数手术不能完全去除肿瘤。放疗和化疗也可能损害健康组织，因此考虑到健康组织的耐受性，放疗和药物剂量必须保持在有限的水平。因此，只有生存的生存能够在几年内得到改善。

番红花具有各种药理作用。它可用于治疗呕吐，牙齿和牙龈疼痛，失眠，抑郁症，癫痫发作，认知障碍，发汗，呕吐，祛痰和壮阳药，并用于治疗肝病，肠胃气胀，痉挛，哮喘，咳嗽，支气管炎，发热，心血管疾病，癌症和许多其他疾病。 Crocin是类胡萝卜素色素，可以使藏红花发红[4]。一些研究报道了crocin的抗癌作用[5-7]。 Crocin是杀死癌细胞而不损伤正常细胞的植物化学物质。因此，它可以与化疗药物联合使用，以减少药物的毒性作用[8]。

紫杉醇是一种化疗药物。由于紫杉醇与beta;微管蛋白亚基结合的能力，它增加了微管的产生并防止它们解聚。这一事件因此破坏细胞的有丝分裂并阻止G2期的细胞导致细胞凋亡[9]。紫杉醇最重要的副作用和剂量限制处方是造血系统的失活。这表现为中性粒细胞减少（中性粒细胞减少），白细胞减少（白细胞减少症）和贫血[10]。紫杉醇可能引起一些心血管并发症，如低血压（低血压），心率（心动过缓）和高血压（高血压）[11]。恶心和呕吐是紫杉醇的其他副作用[12,13]。

DNA是电离辐射的关键目标，因为它包含编码生物分子的信息，所以它的损伤如单链断裂（SSB），双链断裂（DSB）和二聚化可能强烈威胁细胞活力[14,15]。

因此，电离辐射有可能诱导DNA损伤和细胞凋亡[16]。

细胞凋亡术语在1972年首次由Kerr建立，用于描述基于形态学变化的生理细胞死亡并使坏死分化[17]。细胞凋亡是真核生物中常见的细胞死亡类型。该过程在胚胎期和肿瘤抑制过程中进行[18]。

根据乳腺癌患病率的增加以及治疗方案的不良影响，包括化疗药物耐药和化疗和放疗期间对健康组织的损伤，本研究旨在分别评估crocin和紫杉醇和crocin和gamma;射线的协同凋亡作用， MCF-7细胞系

2。材料和方法

2.1。细胞系和试剂

从巴斯德研究所（德黑兰，伊朗）制备MCF-7细胞系，非侵入性雌激素受体（ER）阳性。胰蛋白酶，crocin，3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑鎓（MTT）和碘化丙啶（PI）购自Sigma（德国）。从Gibco（USA）购买具有5％胎牛血清的达尔伯克氏改良伊格尔培养基（DMEM）高葡萄糖。紫杉醇购自Sobhan Darou（伊朗德黑兰）。从Cell Signaling（USA）制备兔半胱天冬酶-7单克隆抗体，半胱天冬酶-9和PARP和p53的小鼠单克隆抗体。

2.2。细胞培养和研究方法

在含有10％热灭活的胎牛血清，100单位/ mL青霉素和100mg / mL链霉素的DMEM高葡萄糖培养基中培养MCF-7细胞，并保持在37℃和5％CO 2的潮湿气氛中。选择对数生长期的细胞进行实验研究。

2.3。 MTT法测定MCF-7细胞存活率

将25000个细胞与1mL培养基接种在24孔板中24小时。对于crocin和不同浓度的1.5mg / mL，2.5mg / mL，3.5mg / mL，4.5mg / mL和6mg / mL，0.01mu;M/ mL，0.03mu;M/ mL，0.05mu;M/ mL，分别检测0.1mu;M/ mL，0.5mu;M / mL和1mu;M / mL的紫杉醇，以在最短时间获得MCF-7的IC50（抑制浓度）。在此基础上，24小时，48小时和72小时使用crocin的孵育时间，48小时使用紫杉醇。然后移除培养基，并将细胞与100mu;L（溶于PBS中的5mg / mL）MTT和900mu;L培养基在37℃下温育4小时。弃去上清液，加入500mu;LDMSO，混悬液悬浮。使用ELISA在570nm波长下测量吸光度（[略];参考PDF]）。最终生存率计算如下：[图略;参考PDF]所有上述步骤分别完成crocin和紫杉醇。结果选择浓度为2.5mg / mL的crocin和0.01mu;M/ mL的多柔比星作为优化浓度。

然后选择4组MCF-7进行研究，分别为对照组，第2组受照剂量为2 Gy伽马辐射（钴60源），第3组接受2.5 mg / mL crocin和0.01mu;M /毫升紫杉醇，最后第二组用2.5毫克/毫升crocin与2 Gy伽玛辐射研究联合组;同时，我们有几个对照组。

2.4。流式细胞仪检测细胞凋亡

流式细胞术显示凋亡细胞使用PI染色来检测所谓的亚G1峰[19]。对于该测定，将MCF-7细胞在6孔板（每孔70000个细胞）中培养并用2.5mg / mL crocin处理24小时，48小时和72小时。第二组细胞用0.01mu;M/ mL的紫杉醇处理，第三组用2Gygamma;照射。为了评估联合治疗，第四组用2.5mg / mL crocin和0.01mu;M/ mL紫杉醇处理48小时，第五组用2Gygamma;和2.5mg / mL crocin处理24小时。然后，对照组旁边的所有组进行流式细胞术分析。

2.5。 Western Blot检测MCF-7细胞Caspase-7和Caspase-9及p53和PARP的表达

将MCF-7细胞系分类并处理，与之前的两种方法类似。然后通过胰蛋白酶消化将处理的细胞分离，用PBS洗涤，以4000rpm离心5分钟，并加入到RIPA（裂解缓冲液）中。在下一步中，将所有样品放入冰中30分钟，并且每5分钟涡旋一次，直到其均匀分布。然后将样品在4℃下以13000rpm离心20分钟。取出上清液，用Bradford法测定蛋白质浓度。将蛋白质样品分成更小的量并保持在-80℃。

首先制备运行缓冲液和转移缓冲液的蛋白质印迹，然后进行三个步骤：（a）通过凝胶电泳根据分子量分离蛋白质，（b）转移到硝酸纤维素膜上，和（c）期望的蛋白质与第一抗体一起指定，并用第二抗体显示。最后抗体键出现在ECL上。每个键的厚度与蛋白质的量直接相关。

3.结果

3.1。 MCF-7细胞存活率的变化

MTT显示crocin随着剂量和时间的增加而降低MCF-7细胞系的细胞活力。用该处理48小时后的3.5mg / mL crocin获得了该细胞系的IC 50（[图略）;参见PDF]）（图1）。测量48小时后用0.1mu;m / mL紫杉醇处理的IC50（[图略];参见PDF]）（图1）。

图1：在（a）24小时，（b）48小时和（c）72小时时不同浓度的crocin的Mcf-7细胞的存活率。 （d）通过MTT测量48h内不同浓度的紫杉醇的Mcf-7细胞的存活率。

（a）用crocin mg / mL 24小时的MTT测定

（b）用crocin进行MTT测定48小时

（c）用crocin mg / mL 72小时的MTT测定

（d）紫杉醇mu;Mol/ mL 48小时的MTT测定

这项研究表明，联合使用0.01mu;mol / mL紫杉醇和2.5 mg / mL crocin后48 h可能对MCF-7

细胞系产生IC50（图2）。这个结果是通过MTT分析发现的。 2 Gy伽马辐射与2.5 mg / mL crocin的联合治疗也显示50％的细胞死亡（参见PDF）（图3）。单独使用2 Gy辐射的细胞死亡率大于22％。

图2：不同浓度的crocin 2.5 mg / mL和0.01mu;m / mL紫杉醇48 h的Mcf-7细胞的存活率。

图3：2 Gy辐射的Mcf-7细胞存活率24 h和2 Gy辐射24 h和crocin 2.5 mg / mL 48 h组合的存活率。

3.2。 MCF-7细胞的凋亡变化

用PI流式细胞术来评估细胞凋亡。凋亡细胞的主要特征之一是DNA片段化。因此，细胞的核DNA含量低于正常细胞。可以通过DNA结合荧光染料如PI [20]评估和指定含二核苷酸的细胞。凋亡细胞群由SUBG1峰定义。

该研究揭示，在24,48和72小时用2.5mg / mL crocin处理可以引起MCF-7细胞系随时间的凋亡增加（图4）。同时发现2.5 mg / mL crocin和0.01mu;mol/ L紫杉醇的联合治疗可显着增加细胞凋亡，显着高于单一治疗组（图略）（图4）。

图4：通过PI流式细胞术测量细胞凋亡：（a）对照48小时，（b）crocin 2.5mg / mL 24小时，（c）crocin 2.5mg / mL 48小时，（d）crocin 2.5mg / mL 72小时，（e）紫杉醇0.01mu;m / mL，（f）crocin 2.5 mg / mL 紫杉醇0.01mu;m / mL，（g）放射2Gy 24 h，和（h）crocin 2.5 mg / mL 48 h 放射2 Gy 24小时。

本研究表明，2 Gy伽马射线联合Crocin联合治疗可将MCF-7细胞系的凋亡从21％（与单独使用2 Gy伽玛辐射有关）提高至46.6％（[图略];参见PDF]）（图4）。

3.3。 Western Blot检测MCF-7细胞Caspase-7和Caspase-9，p53及PARP的表达

Western blot检测结果显示MCF-7细胞系与crocin和紫杉醇或crocin联合治疗，放疗可以增加caspase-7和caspase-9，p53和PARP等4种蛋白的表达，高于单独治疗（[图略] ;参考PDF]）（图5）。

图5：（a）通过2.5和4.5mg / mL crocin处理的细胞的蛋白质印迹，（b）通过紫杉醇0.01mu;m / mL和紫杉醇0.01mu;m / mL crocin2.5mg / mL处理的细胞的蛋白质印迹，和（c）2Gy伽马辐射和2Gy 克隆蛋白2.5mg / mL的蛋白质印迹。

4，讨论

如前所述，乳腺癌是世界上妇女中最常见的恶性肿瘤。尽管在癌症患者中使用包括手术，化疗和放疗在内的常规治疗方法，但其死亡率依然很高。这意味着这些治疗方式需要修改。另外，化疗和放疗对正常细胞的破坏作用是其他重要的问题[11]。如今，趋势一直集中在具有抗癌特性的天然产品如藏红花上以获得更好的癌症治疗。

Chryssanthi等人。表明番红花（crocin，crocetin和safranal）的成分可以阻止MCF-7细胞系的增殖[12]。我们的研究批准了crocin的这种抗增殖作用。其他科学家已经批准了crocin，藏红花类胡萝卜素色素对HEPG2细胞的抗增殖作用，以及对正常细胞没有有害影响的结直肠癌细胞[13-15]。我们的研究评估了用紫杉醇，crocin，辐射和使用MTT测定法处理MCF-7细胞的存活率。我们的研究表明crocin可以剂量和时间依赖性方式抑制MCF-7细胞的增殖。例如，当在48小时内crocin浓度从1.5mg / mL增加到6mg / mL时，MCF-7细胞的存活率从75％降低到23％，并且MCF-7细胞的存活率从80在48小时内用0.01mu;M/ mL至1mu;M/ mL的紫杉醇处理细胞中的％至17％。紫杉醇以剂量依赖性方式降低存活率。类似于我们的结果Hoshyar et al。显示crocin的剂量依赖性和时间依赖性效应。

孙等人。揭示了crocin对Tca8113的凋亡作用[16]。我们的研究批准了MCF-7细胞系的这种作用。 Li等人揭示

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