癌症靶向疗法新工具：寡核苷酸适配体外文翻译资料

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癌症靶向疗法新工具：寡核苷酸适配体

Hongguang Sun , Xun Zhu , Patrick Y Lu , Roberto R Rosato , Wen Tan and Youli Zu

适配体是一类由RNA或单链的DNA寡核苷酸组成的，对靶点有高特异性与亲和性的小型配体。由于核酸适配体如同抗体一般地通过特殊的三维结构与靶点作用，所以又被称之为“化学抗体”。由于其寡核苷酸的特性，与蛋白质抗体相比，适配体具有独特的化学与生物性质。因此适配体更适合研发新的临床应用。适配体技术在生物医药领域中得到了广泛的研究，例如：生物标记发现，体外诊断，活体显像以及靶向治疗。本文将探讨适配体技术作为靶向治疗癌症的新工具的潜在应用，并重点探讨能够特异性以细胞表面的生物标记为靶的适配体的研发。另外，我们还将描绘出一些靶向治疗学领域的适配体的应用。包括适配体与药物的结合，适配体与纳米粒子的结合，适配体调节靶向基因疗法，适配体调节免疫疗法，以及适配体调节生物疗法。

分子疗法-核酸 (2014) 3, e182; doi:10.1038/mtna.2014.32; 发布于2014 年 8月 5 日

主题分类: 适配体，核糖酶，脱氧核糖酶。

简介

“适配体”和“SELEX”两个概念是于1990年由两个独立的小组提出。“适配体”是指表现出特定治疗学功能并对其靶点有明确亲和性的小型核酸配体。相对的，指数富集配基的系统进化技术（SELEX）则是用于适配体研发的一种手段。尽管使用小型核酸分子作为治疗手段已经有几十年的历史，SELEX以及适配体技术在此领域的创新依然是革命性的。
适配体最重要的性质，如其拉丁文词源（aptus，意为“量体裁衣”）一样，是其高选择性。这些由化学合成的小型单链RNA或DNA寡核苷酸会折叠成特殊的三维结构，其解离常数通常在皮摩尔到纳摩尔量级。此外，同其他核酸分子探针相比较，适配体是通过结构识别来与其靶点相互作用并结合的（见图1）。这种作用和抗原-抗体之间的相互作用相似，因此适配体又被称作为“化学抗体”。
与蛋白质抗体相比，适配体的优势在于由其微小的体积以及寡核苷酸的特性带来的更广泛的临床应用以及更加简便的工业合成过程。特别地，(i)适配体因其与蛋白质相比极小的分子量（适配体约8-25kDa而抗体约150kDa）能够更快，更高效地渗透入组织内。所以，适配体可以比大体积蛋白质更加高效地在体内穿越组织屏障并且到达靶点。(ii)适配体在体内几乎是非免疫原性的。原则上来说，鉴于适配体实质上是寡核苷酸，那么它应该不会被免疫系统识别。而从实践上来说，一个近期的临床研究表明在在体情况下适配体不会激活免疫反应。与蛋白质抗体相比较，尤其是在反复注射之后，适配体可以说是具有高度非免疫原性了(iii)。
适配体还具有热稳定性。基于寡核苷酸的内在特性，即使在95摄氏度条件下使其变性之后，一旦冷却至室温，适配体依然能够重新折叠至其正确的三维结构。相比之下，以蛋白质为本质的抗体在高温下会永久失去其活性。更重要的是，一个成熟的合成方案和化学修饰技术可以实现(iv)快速地大规模适配体的合成，并且还具有包括了多种功能模块，(v)化学合成过程中机构变化较少，且(vi)花费更低的修饰能力。还有一点，适配体能够特异性识别多种靶点，比如离子、药物、肽链、蛋白质、病毒、细菌、细胞甚至是组织。已适配体为基础的疗法在临床上正如火如荼地发展着。举个例子，哌加他尼就是一种靶点为血管内皮生长因子的经过修饰的RNA适配体。哌加他尼已获得美国食品药品监督管理局（FDA）许可，用于治疗湿性老年性黄斑变性并正在评估用于其他病症的可能性。AS1411在癌症中会以核仁素为靶点，这是一种在多种肿瘤中过度表达的蛋白质。目前，它被认为是实体瘤和急性髓细胞白血病的潜在治疗选择。表1和参考文献16中包含了关于在进行临床试验的治疗用适配体的已更新的列表。所有的这些临床研究都强调了适配体具有的包括治疗学在内的多种生物医学领域的应用的可行性。

而自从适配体技术被提出以来，RNA的序列档案馆就被SELEX技术广泛应用。基于现有的证据，我们有理由相信存在2rsquo;-OH基团和非沃森-克里克碱基配对使得RNA适配体寡核苷酸能够折叠成比ssDNA分子更多样化的3D结构。因此，使用更灵活的RNA序列简化了高亲和性和特异性适配体的开发。但尽管具有这么多的优势，RNA序列却对生物环境中的核酸酶非常敏感，并且可以被迅速降解。为了增强RNA适配体对酶的抗性，目前正在对几种化学修饰方法进行研究。有证据表明RNA序列中的2rsquo;-OH基团和磷酸二酯键是核酸酶水解的位点。故将2rsquo;-OH官能团使用2rsquo;-氟，2rsquo;-氨基，或2rsquo;-O-甲氧基基取代，和/或将其改变为磷酸二酯骨架与硼酸酯或硫代磷酸酯是旨在增加RNA适配体核酸酶抗性的最常见的修饰方法。日前，Wu等人开发出了一种新的修饰方法来增加siRNA的稳定性。这种方法是将同一核苷酸中的二硫代磷酸酯和2rsquo;-氧-甲基同时取代。这种修饰方法显著增强了siRNA的稳定性，代表了在复杂的生物系统中利用RNA疗法的潜在的新方向。最近报道的其他有效修饰方法是使用锁定核酸技术或生成“镜像”的RNA序列结构，这种方法称为spiegelmers。这些修饰导致RNA序列的结构改变，从而使RNA序列不能被核酸酶分解。

除了RNA适配体以外，ssDNA适配体同样也在开发中。由于其缺少2lsquo;羟基基团，DNA分子天然具有对2rsquo;核酸内切酶的抗性，并且在生物环境中稳定。我们的团队最近开发出了具有生物稳定性的DNA适配体，并且能特异性结合一种霍奇金和间变性大细胞淋巴瘤中过度表达的蛋白质生物标记CD30。功能分析表明此种ssDNA适配体即使在浓度低至2 nmol/l展时依然现出了对CD30的高亲和性，并且在人的血清中稳定长达8小时。相对地，在相似的条件下，CD30的RNA适配体在十分钟内就被分解了。

总的来说，独特的化学结构和生物学功能使得适配体在过去20年间的研究中成为一个非常有吸引力的工具。目前，在PubMed数据库中发表的包括“适配体”一词的文章超过4000篇与适配体技术有关的研究领域包括生物测定、药物开发、细胞检测、组织染色、体外和体内成像、纳米技术和靶向治疗。适配体作为化学抗体是替代或补充蛋白质抗体的一种很好的选择，并且在临床上已被广泛应用。

图1 适配体与靶点结合的示意图

表1目前正在进行临床试验的治疗适配体列表

特异性靶向细胞表面生物标记的适配体

利用SELEX技术开发细胞表面生物标记的适配体

SELEX是一种基于重复扩增和富集过程，用于开发针对人们感兴趣的特异性目标的适配体的方法。SELEX过程遵循以下几个步骤：首先，化学合成一个包含1014至1015个独特的随机序列并且侧面有引物的结合位点的随机ssDNA寡核苷酸文库这一步利用了一下这些通用的体系：5rsquo;-引物序列-（随机序列）反义引物序列-3rsquo;，其中引物序列从18到22个碱基不等，随机序列则包含20-40个核酸。一般步骤包括标记5lsquo;端带有荧光指示剂的引物来监控适配体的选择，同时3rsquo;端反义引物用诸如如生物素一类的具有亲和性的分子标记来用于分离在每个扩增轮中产生的单链寡核苷酸。这个随机的ssDNA文库可以直接用于选取DNA适配体的初始池。相反，RNA适配体的产生则需要两个额外的步骤。具体来说，首先产生一个随机ssDNA寡核苷酸池，并将T7 RNA聚合酶启动子序列添加到5rsquo;-意义引物中，然后将DNA用作5rsquo;到3rsquo;方向上的T7 RNA聚合酶基转录模板。在第二个SELEX的步骤之中，寡核苷酸文库会被加热后迅速冷却来促使其三维立体结构的形成。文库随后便会与人们感兴趣的靶点混合来富集能够与靶点特异性结合的序列。在第三个步骤中，那些未结合的序列就会通过使用膜、柱、磁珠和毛细管电泳等方法被弃去。在第四步中，通过PCR（适用于DNA适配体）或RT-PCR（适用于RNA适配体）来扩增富集的序列，从而为下一轮SELEX产生新的序列文库。扩增的序列文库可以通过进一步的反选择，从而消除由非靶点部分结合产生的非特异性序列。最终，适配体的选择会经历4到20轮的扩增和富集。所需扩增和选择步骤的确切数目取决于适配体目标是纯化的蛋白质还是活细胞，以及如通过凝胶电泳、流式细胞术（用于靶向结合）、经典克隆或测序，或通过高通量下一代测序（NGS）等方法所建立的适配体序列文库的进化。近年来，传统的SELEX方法也已经被修改以增加包括毛细管电泳（CE）SELEX、切换选择、照片SELEX、基于微球的选择、X适配体和慢化率缓速改性适配体（SOMAmers），从而以最大限度地提高其亲和性和特异性，以提高选择的速率和成功率，并向被选择的适配体提供额外的属性。

与蛋白抗体的开发相类似地，在原核或真核系统中表达的纯化的重组蛋白或肽可以用于作SELEX方法所选择的适配体的靶点。但是，由于是在翻译后修饰，纯化的蛋白质或肽常常不能折叠成在生理条件下形成的正确的3D结构，特别是在高度糖基化蛋白的情况下尤其如此。因此，新合成的适配体可能不能选择性地识别相应的与它们相互作用的靶点，这将导致适配体在生物医学应用上的的失败。鉴于这是一个普遍性的问题，在其原本的构造之中为适配体选择生物标记也就变得十分重要。考虑到这个问题，最近建立了一种改进的SELEX技术， 叫做以细胞为基础的 SELEX（或细胞SELEX），不同于原先的SELEX，这种技术则是使用了整个活细胞。为了开发细胞特异性适配体，细胞SELEX方法使用会表达我们感兴趣的表面生物标记的整个活细胞。然而，除了目标生物标记之外，许多不同的细胞表面分子的存在会导致许多不相关的/不想要的适配体的合成。因此，除了上述所有SELEX步骤之外，细胞SELEX技术还需要在反选阶段利用不会表达目标生物标记的控制细胞来挑选出不需要的适配体。

高水平的内源性表达的生物标记，如ErbB超家族、MUC1、EpCAM和CD30，提供了基于细胞的适配体发展的最佳潜能。并且，具有细胞特异性或癌型特异性生物标记的高内源表达的细胞系通常用于细胞SELEX。然而，如果这样的细胞系不可用，可以通过基因转染和用于反选择的亲代细胞在一个特定的细胞系中过度表达我们需要的生物标记。通过使用这种方法，靶向肿瘤干细胞（CSC）生物标志物CD133的适配体最近已经被开发出来。在本研究中，将CD133 cDNA转染到HEK23T细胞中，然后将其用于适配体富集，以亲代HEK29 3T细胞作为阴性对照。类似地，最近还开发出了针对人受体酪氨酸激酶的适配体。

尽管细胞SELEX系

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