多功能包膜型介孔二氧化硅纳米粒子用于肿瘤触发靶向药物递送外文翻译资料

 2022-06-30 11:06

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多功能包膜型介孔二氧化硅纳米粒子用于肿瘤触发靶向药物递送

Jing Zhang, Zhe-Fan Yuan, Ya Wang, Wei-Hai Chen, Guo-Feng Luo, Si-Xue Cheng, Ren-Xi Zhuo,and Xian-Zheng Zhang*

武汉大学生物医学高分子教育部重点实验室，武汉430072，中国

摘要：设计了一种新型的细胞摄取屏蔽多功能包膜型介孔二氧化硅纳米粒子（MEMSN），用于肿瘤触发靶向药物递送至癌细胞。 通过二硫键连接谷胱甘肽诱导的细胞内药物释放，beta;-环糊精（beta;-CD）锚定在介孔二氧化硅纳米粒子的表面上。 然后将含有Arg-Gly-Asp（RGD）基序和基质金属蛋白酶（MMP）底物肽Pro-Leu-Gly-Val-Arg（PLGVR）的肽序列引入到纳米粒子通过主客体相互作用。 保护定位配体并且防止纳米颗粒被正常细胞摄取，纳米颗粒进一步用聚（天冬氨酸）（PASP）修饰以获得MEMSN。 体外研究表明MEMSN对正常细胞有屏蔽作用。 在到达肿瘤细胞后，可以通过在富含MMP的肿瘤细胞上通过水解PLGVR去除PASP保护层来打开靶向特性，这使得肿瘤细胞易于摄取载药纳米颗粒，并且随后将谷胱甘肽诱导的药物释放在细胞内。

介绍

对于癌症治疗，药物输送方式起着重要的作用。

在药物活性分子的抗癌作用中发挥作用。由于传统的抗肿瘤药物不能区分患病细胞和健康细胞，因此癌细胞内的药物剂量总是有限的，并且具有不希望的副作用的全身毒性是不可避免的。 为了提高药物在癌症治疗中的治疗指数，已经开展了大量的研究工作来开发用于肿瘤靶向药物递送的理想药物载体。 然而，在药物递送系统向肿瘤细胞的运输过程中存在几个障碍，例如循环过程中的聚集和快速清除以及正常细胞的非特异性摄取。 为了克服这些障碍，理想的药物载体应该结合多种功能，例如保护载体以保持载体稳定并避免非特异性细胞摄取，肿瘤靶向在肿瘤部位累积的能力，用于高效细胞进入的配体介导的细胞粘附，和有效药物包封以仅允许药物在肿瘤细胞内释放。

最近，提出了“程序化包装”或“多功能包膜型纳米装置（MEND）”的新概念，以克服基因递送至靶细胞核的过程中的各种障碍。在MEND中，质粒DNA被聚阳离子浓缩，然后用脂质双层包被，类似于包膜型病毒。 然后将功能组分，例如增强细胞摄取的特异性配体和促融合脂质与内体膜融合，引入双层。 与传统输送系统相比，MEND具有独特的优势，因为组装的功能组分在合适的位置以及在适当的时间发挥其特定功能以获得最佳细胞内药代动力学和药效学。 受MEND概念的启发，我们设计制造了一种多功能信封型药物载体，可以克服药物转运过程中在癌细胞中靶向给药的复杂障碍。

据报道，药物载体的表面电荷在体外和体内对它们的结果有严重影响。由于与血清成分的强烈相互作用，带正电荷的纳米颗粒可能导致严重的聚集和循环中的快速清除，这限制了它们潜在的体内应用。相反，带负电的载体有利于蛋白质抗性。此外，带负电的纳米粒子在使用过程中表现出延长的循环时间在我们以前的研究中，我们也证明聚阴离子载体可以避免非特异性细胞摄取。因此，具有聚阴离子外层的药物递送系统具有若干有利特征，包括生理条件下的增强的稳定性和血液中的延长的循环时间。药物递送系统的负电荷外层有利于延长体循环时间并因此实现被动靶向。

肿瘤部位由于增强的渗透性和保留（EPR）效应，负电荷表面对靶细胞摄取的不利影响。 为了解决这个问题，制造聚阴离子保护的药物载体是非常合乎需要的，所述药物载体可以改变它们的表面性质并在到达靶向肿瘤部位后变得可被癌细胞识别。 换句话说，运载体应该有一个“肿瘤触发瞄准”属性。 据我们所知，具有肿瘤触发靶向性质的药物载体仍然很少被研究。

为了实现肿瘤触发的靶向特性，能够触发药物载体表面性质转换的肿瘤定位信号（TLS）是至关重要的。 据报道，几种TLS去除保护层并暴露受保护的靶向配体以响应肿瘤的酸性环境。 例如，Wang等人 开发了用于肿瘤酸性靶向siRNA递送的三元纳米颗粒。 通过对肿瘤酸性的特异性反应，纳米颗粒显示肿瘤细胞的摄取增强，并且在癌症治疗中提高了siRNA的递送效率。在我们之前的研究中，我们还报道了具有在pH lt;6.8下移除PEG隐形层的能力的荧光药物载体，并暴露RGD-靶向基序以改善肿瘤细胞的摄取。然而，在实际应用中，肿瘤部位和正常组织之间的pH衰减可能不足以触发去除屏障过程。 我们知道，基质金属蛋白酶（MMPs）的异常增加与具有肿瘤侵袭性，转移和血管生成密切相关的。由于MMPs在细胞外环境中过表达在某些肿瘤中，MMPs可以用作癌症治疗中的一种TLS。 设计能够响应MMP的肿瘤触发靶向药物载体具有临床必要性。 而且，传统的药物载体总是在流通过程中意外地释放药物。 理想的药物载体应该能够在到达肿瘤部位之前有效包封药物。 在这方面，介孔二氧化硅纳米粒子（MSN）作为药物载体有其独特的优势。除了它们稳定的介孔结构外，还有很大的表面面积，可调的孔径和良好的表面，这对药物负载有利，MSN可以进一步用单层门控包封。 例如，环状糊精（CD）门控MSN能够高效地将不同的药物捕获在介孔中，并允许从介孔中释放药物，直到出现特定的外部触发，例如氧化还原电位， pH值，光，和酶。

在这项研究中，我们制造了一种新型的多功能包膜型介孔二氧化硅纳米粒子（MEMSN），以所谓的“程序化包装”方式实现肿瘤触发的靶向药物输送。 如Scheme所示 1, 盐酸阿霉素（DOX）是一种抗癌药物。

方案1. MEMSN的结构和肿瘤触发的靶向药物递送

a

（A）MSN的特异功能化; （B）在生理条件下加载MEMSN的药物; （C）在肿瘤部位响应于MMP去除PASP保护层; （D）通过RGD介导的相互作用摄取细胞; （E）细胞内谷胱甘肽触发的药物释放; 和（F）肿瘤细胞的凋亡。

结果与讨论

在这项研究中，我们合成了MSN的平均直径为140nm，如图中的扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）图所示 图1A，C。高度有序的晶格阵列表示a

图1.（A）MSN的SEM图像; （B）MSN的低角度XRD图案; （C）

MSN的TEM图像; 和（D）载有DOX的MSN-SS-CD-肽-PASP的TEM图像。

负载在表面连接的介孔二氧化硅核心中与与beta;-CD通过二硫键结合。 纳米粒子是进一步用RGD和PLGVR肽和聚阴离子（PASP）修饰。 聚阴离子保护层可以避免生理条件下的非特异性摄取。 在纳米粒子到达肿瘤位点后，可以通过MMP底物肽（PLGVR）的水解除去聚阴离子保护外层，导致靶向RGD基序的暴露。 此后，纳米颗粒将被肿瘤细胞摄取，并且药物可以从纳米颗粒快速释放，因为由于浓缩谷胱甘肽（GSH）在肿瘤细胞内诱导的二硫键连接体的破坏，可以去除CD门控系统。

得到的MSN具有均匀，良好的介孔结构，其进一步通过X射线衍射（XRD）分析（图 1B). 通过FT-IR表征MSN的表面官能化 。 如图所示 方案S1， MSN的表面首先用3-巯基丙基三甲氧基硅烷官能化以获得MSN-SH。 FT-MSN-SH的红外光谱在2560cmminus;1处显示硫醇吸收带。 此后，合成MSN-SS-NH2，其与炔丙基溴反应生成MSN-SS-炔。 炔烃部分在2125minus;1厘米处的典型吸收峰证明了炔部分的成功官能化。

图2.不同纳米粒子的TGA曲线：MSN，MSN-SS-CD，未加载的MSN-SS-CD-肽和未加载的MSN-SS-CD-肽-PASP。

然后通过用含有MeOH和HCl的溶液回流，从MSN-SS-炔烃中除去表面活性剂模板十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）。 通过剧烈搅拌MSN-SS-炔烃纳米颗粒和DOX溶液的混合物24小时，将DOX加载到纳米颗粒的孔中。 随后，通过单-6-叠氮基-beta;-CD和MSN-SS-炔之间的“点击化学”将门控beta;-CD固定在装载或卸载DOX的MSN-SS-炔上以获得MSN-SS-CD。 如图中的热重分析（TGA）曲线所示 2, 质量减轻当温度升高到800°C时，释放的MSN-SS-CD和MSN的值分别为15.5％和9.8％。 释放的MSN-SS-CD的质量减轻增加表明beta;-CD成功地固定在纳米颗粒的表面上。

为了实现肿瘤触发的靶向，将肿瘤靶向配体和肿瘤环境触发的可切割接头引入MSN-SS-CD。 这是众所周知的整联蛋白受体过表达。在各种癌细胞中，并且RGD基序可以通过RGD-整合素相互作用特异性结合癌细胞。 在这项研究中，RGD被用作肿瘤靶向配体来增强肿瘤细胞纳米颗粒的摄取。 此外，为了在肿瘤环境下接通靶向性质，还将MMP底物肽（PLGVR）引入到纳米颗粒中。 将含有功能肽序列N3GPLGVRGRGDK-Ad的组分装配到MSN-SS-CD通过Ad和beta;-CD之间的“主 - 客”相互作用（方案 1A). 该方案提供了肽的详细合成程序。为了合成肽，首先合成Fmoc-Lys（AD）-OH。 1H NMR鉴定Fmoc-Lys（AD）-OH的结构。然后手动制备肽。通过ESI-MS分析含有肽序列的组分的分子量。典型的吸收峰叠氮化物部分在2113cmminus;1 处成功掺入含有肽的组分。

在将肽序列引入纳米颗粒后，通过点击化学将生物相容且可降解的聚阴离子PASP与叠氮化物部分共价偶联以形成保护层。 如图所示，合成PASP（obzl）- 炔-天冬氨酸4-苄基酯N-羧基-酐（Asp（obzl）-NCA），通过H-Asp（obzl）-OH的分子内闭环获得。之后，炔丙基胺被用作Asp（obzl）-NCA开环聚合的引发剂，导致形成PASP（obzl） - 炔。通过SEC-MALLS确定PASP（obzl） - 炔的分子量（Mw= 4211）和多分散指数（PDI = 1.13）。PASP-炔在碱性条件下脱保护4-苄基酯基后得到。 用FT-IR和1H表征了PASP-炔的结构NMR（图S4）。 在2120cmminus;1处的吸收峰证实了炔烃基团的存在。另外，PASP信号（2.66和4.39ppm）的出现和来自obzl组的信号的消失表明PASP-炔已成功合成。将PASP-炔引入纳米颗粒表面后，获得MSN-SS-CD-肽-PASP（MEMSN）。消失在2113cmminus;1的典型吸收峰表明MSN-SS-CD-肽的外表面上的叠氮基团完全反应。载有DOX的MSN-SS-CD-肽-PASP的zeta;电位（-25.8mV）降低 （表 S1）也表明带负电荷的PASP成功引入纳米颗粒表面。

在用CD门控，肽和PASP修饰后，获得的载有DOX的MSN-SS-CD-肽-PASP纳米颗粒没有表现出明显的尺寸增加（图 1D). 载有DOX的MSN-SS-CD-肽-PASP在去离子（DI）水和含有10％血清的PBS中的颗粒大小分布之间的比较显示它们之间没有显着的差异，表明在血清存在下不发生聚集。 从图中 2, 计算出纳米颗粒中CD，肽和PASP的重量百分比分别为5.7,4.8和11.2％。 CD：肽：PASP摩尔比约为1：1：1，表明官能团之间完全反应。不同的表面积和孔径纳米颗粒由Brunauer-Emmett-Teller（BET）和Barrett-Joyner-Halenda（BJH）分析确定。 如 表S2和图S6所示， 在官能化过程中BET孔体积和BJH孔径减小。

为了评估PASP的MMP-2响应性去屏蔽，比较了MMP抑制剂不存在和MMP抑制剂存在下的体外释放。 如图所示 3, MEMSN表现出对MMP-2的敏感反应以除去PASP。 与MMP-2孵育4小时后，大约53.6％的PASP被释放。 相比之下，在MMP抑制剂存在下暴露于MMP-2 120小时后，几乎没有PASP释放。 这些结果表明MEMSN显示出高的MMP选择性，因此在肿瘤环境中可以特异性地开启MEMSN的靶向特性。

为了研究MEMSN的肿瘤触发靶向能力，将装载DOX的MSN-SS-CD-肽-PASP纳米颗粒与SCC-7（鳞状细胞癌）细胞，HT-29（人结肠癌）细胞分别温育，这是众所周知的高MMP表达。如图 4A-C所示，红色荧光可能与SCC孵育4小时后在SCC-7细胞中清楚地观察到MEMSN在没有MMP抑制剂的情况下，表明颗粒被细胞摄取。 这是由于SCC-7细胞分泌的MMP对肽序列PLGVR的水解造成了PASP层的去屏蔽和靶向RGD基序的暴露。 相反，红色在MMP抑制剂存在下与MEMSN温育后，在SCC-7细胞中不能观察到荧光（由于释放DOX）（图 4D，E）， 这意味着颗粒没有被细胞摄取，这与图3中所示的结果一致 , 即在存在MMP抑制剂的情况下几乎没有从MEMSN中除去PASP，并且因此聚阴离子PASP保护的颗粒的细胞摄取是不可检测的。 对于HT-29细胞观察到类似的现象。 如图5所示 , HT-29中的荧光强度。

图3.在不同条件下从未加载的MEMSN释放PASP。 （■在存在MMP-2和▲存在MMP-2和MMP抑制剂的情况下）

图4.在MMP抑制剂的（A-C）缺失和（D-F）存在下由装载有DOX的MEMSN处理的SCC-7细胞的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像。 （A，D）红色荧光图像; （B，E）共焦区域图像; （C，F）共焦的重叠

荧光和明亮的图像。 （比例尺是50mu;m）。 （G）在没有处理（空白）的情况下（红色）和存在（蓝色）MMP抑制剂和未处理（空白），用装载有DOX的MEMSN处理的SCC-7细胞的流式细胞术分析。

图5.在（A-C）缺失和（D-F）MMP抑制剂存在下，通过装载DOX的MEMSN处理的HT-29细胞的CLSM图像。 （A，D）红色荧光图像; （B，E）共焦区域图像;（C，F）共焦荧光和明亮图像的重叠。（

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