一种基于二氢卟酚用于治疗光动力治疗结肠癌纳米金属有机骨架外文翻译资料

 2022-07-08 03:07

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一种基于二氢卟酚用于治疗光动力治疗结肠癌纳米金属有机骨架

摘要：

我们在这里报告一种基于二氢卟酚的纳米级金属 - 有机框架（NMOF），DBC-UiO的合理设计，它比之前报道的基于卟啉的纳米级金属 - 有机框架DBP-UiO具有更强的光动力物理学性质。通过还原DBPUiO中的DBP配体，成为DBC中的配体，会导致在光谱中13nm的红移而且在最低能带Q的消光系数会增加11倍。DBC-UiO不仅继承了DBP-UiO的结晶度，稳定性，孔隙率和纳米粒子形态，而且对光线更敏感、能更高效的产生单线态氧，实验数据显示它显著增强了两种结肠癌小鼠模型的光动力治疗（PDT）功效。细胞凋亡和免疫原性细胞死亡均有助于杀死DBC-UiO诱导的光动力疗法中的癌细胞。

正文：

光动力治疗（PDT）由三个内在无毒性的基本要素构成： 光敏剂photosensitizer (PS) 、照射光和细胞内的氧气。 其基本原理是利用光敏剂吸收激发光，将肿瘤内的溶解氧活化，成为具有细胞毒性的活性氧，这种成分会导致细胞凋亡和坏死，从而实现对肿瘤细胞的杀伤。相比于其他系统性的癌症治疗方式，光动力治疗基于光敏剂和激发光能针对局部输送到肿瘤细胞区域，而对于正常组织细胞的损伤能达到最小化，所以近年来被广泛采用治疗癌症和其他疾病。

纳米粒子正在被不断地研究作为光敏剂载体的一种，去提高在肿瘤中的光动力治疗的效率。然而，由于难以同时优化ROS的产生和运输至细胞内细胞器引起的细胞死亡，所以纳米粒子PS在PDT中仅获得有限的成功。我们最近报道了一个成功使用卟啉作为药物的纳米金属有机框架（NMOF）载体-DBP-UiO ，它作为光敏剂的载体用于光动力治疗中，在水性环境中能保持稳定，并且其5,15-二（对苯甲酸）卟啉（DPB）配体能很好地彼此分离开从而避免了自淬灭。重Hf4 离子与DBP配体的羧酸根基团的配位增强了系间杂交（ISC）以增加单线态氧的产生效率，而DBP-UiO的纳米多孔形态和多孔结构使ROS从载体的内部扩散更加容易，这些改变使得光动力治疗头颈癌的效率大大的提升。尽管在试验动物的研究中表现出色，DBP-UiO的光物理性质实际上还并不理想，它的最低能量吸收为634nm消光系数（ε）也相对较小，为2200M-1·cm-1。在这里，我们报道了一个氯代的纳米级金属有机复合框架，DBC-UiO的合理设计，在两种结肠癌小鼠模型中具有大大改善的光物理性质和光动力治疗效率 。值得注意的是，尽管近年来已经报道了许多基于卟啉的纳米金属有机框架，但DBC-UiO代表了第一种基于二氢卟酚的纳米金属有机框架，是非常具有突破性意义的。

通过光照产生单线态氧的示意图

使用LED灯照射DBC-UiO进行光敏化生成单线态氧

血卟啉衍生物是开发的第一代光动力治疗光敏剂，并作为1993年第一代临床应用的光动力治疗剂中的光敏剂。然而，卟啉的光物理性质不是非常理想，其吸收峰典型地接近组织的高能边缘 - 穿透窗口（600-900 nm），ε值也较小。在光敏剂分子的设计中，将卟啉还原成二氢卟酚会引起红移同时引起ε值提高。例如，将5,10,15,20-四（间羟基苯基）卟啉还原成其二氢卟酚衍生物，会将最后一个Q带从644nm移至650nm，并将ε值从3400增加 到29600M-1·cm-1。所以我们可以假设基于二氢卟酚的纳米金属有机框架与DBP-UiO相比会改善其光物理性能，使光动力治疗的效率提高。

用甲苯磺酰肼部分还原5,15-二（对甲基苯甲酸）卟啉（Me2DBP），得到5,15-二（对甲基苯甲酸）二氢卟酚（Me2DBC），产率为26％。Me2DBC的碱催化水解以88％收率得到5,15-二（对苯甲酰） - 二氢卟酚（H2DBC）。Me2DBC和H2DBC可以通过NMR光谱和质谱进行表征（支持信息[SI]中的图S1-S4）。在N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中使HfCl4与H2DBC进行溶剂热反应得到DBC-UOO，为暗紫色粉末，用再用DMF，1％（v / v）三乙胺（NEt3）的乙醇溶液和乙醇依次洗涤，然后使其悬浮在乙醇中保存。

粉末X射线衍射（PXRD）表明DBC-UiO由于DBC和DBP配体之间的几何相似性，DBP-UiO的结构基本与DBC型相同（图1a）。DBC-UiO中的Hf6（mu;3-O）4（mu;3-OH）4二级结构单元通过DBC配体连接用以提供Hf6（mu;3-O）4（mu;3-OH）4（DBC）6的UiO骨架。Hf的含量通过电感耦合等离子体质谱测定（ICP-MS）为24.0％（计算值为23.8％），而在热重分析中观察到DBC重量损失为64％（计算值为72％）（图S5）。DBC-UiO的透射电子显微镜（TEM）图像揭示了类似于DBP-UiO的纳米粒子形态（图1c）。平板直径为100-200nm，直接垂直观察停留在TEM栅格中的颗粒，能确定其厚度在3.3到7.5nm之间变化（图S6）值得注意的是，由于计算出的UiO结构的相邻（111）与填充层（d111）之间的距离为2.2nm，所以超薄板仅由两至四组（111）填充层组成。这种板甚至比DBP-UiO的板更薄（约10nm厚），进一步促进了光动力治疗期间的活性氧的扩散。动态光散射（DLS）测量得到DBC-UiO的平均直径为128.5nm，多分散指数为0.17，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的zeta;电位为-10.2mV（图S7）。

图1. DBC-UiO的特征描述
（a）在细胞培养基中孵育之前和之后，DBP-UiO和DBC-UiO的PXRD图谱。
（b）H₂DBC，DBC-UiO，H₂DBP和H₂DBP的UV-vis的吸收光谱，DBP-UiO的溶剂为DMF或0.67mM PBS。
（c，d）在细胞培养基中温育之前（c）和之后（d），DBC-U10的TEM图像，显示其纳米粒的形态。
（e）1mu;MH₂DBC和DBC-UiO水溶液的稳态荧光。

（f）在0.1W / cm2的辐照度下由DBC-U10，H₂-DBC，DBP-U10，H₂-DBP和PpIX产生1O2。用650nm的LED照射DBC-UiO和H2DBC，而其他的用640nm的LED照射。

符号显示实验数据，实线是拟合曲线。

紫外minus;可见吸收光谱证实了基于二氢卟酚的光敏剂在光物理化学性能上有所改善H2 DBC在lambda;max= 408nm处有一个分裂的Soret谱带和四个Q谱带并且在504,534,591和643nm的波长上DBC-UiO的峰值出现了轻微的红移，对于相对于H₂DBC的所有Q条带，在508、545、592和646 nm。DBC-UiO的最低能带因此相对于DBP-UiO红移了13nm，ε值为24600M-1·cm-1，这是DBP-UiO的11倍。H2 DBC的最低能量ε值为21 800M-1·cm-1在 Q波段，比H2 DBP（1700M-1cm-1）大13倍。

H2 DBC在〜641nm处显示荧光峰（图1e），但DBC-UiO的荧光强度比H₂DBC的值低了约200倍，因为在协调DBC后增强了ISC 通过羧酸根基团与Hf4 离子配位。通过与时间相关的单光子计数测量（图S10和SI中的表S1），DBC-UiO具有7.88ns的荧光寿命，相对于H2DBC的（8.15ns）更短。

单线态氧绿色传感器（SOSG）可以用来测定H₂DBC和DBC-UiO的游离态单线态氧的产生效率。SOSG与产生的单线态氧反应，会产生绿色荧光（lambda;em= 525nm），这种荧光可以定量的计算，用来统计单线态氧的产率。为了进行比较，我们分别测定了H₂DBP，DBP-U10和原卟啉IX（PpIX）的1O₂产生效率。荧光强度（IF）对照射时间（t）的曲线拟合指数函数等式为：I = A（1-e-kt）F（1）其中A和k是拟合参数（表1）。4图1f所示的拟合曲线表明了伪一阶单线态氧的生成过程。4将总二氧化碳产生量与PpIX的总产量进行了标准量化，以便比较总体的光敏效率。结果表明，在生成1O₂时，DBC-UiO的效率是DBP-UiO的约3倍。在培养RPMI 1640细胞中的NMF后，通过TEM和PXRD证实DBC-UiO在生物培养基中的稳定性，培养时间为12小时。

表① 单线态氧的代曲线的拟合参数

A

k (minminus;1)

normalized yield

H2DBC

102

0.25

4.3

DBC-UiO

195

0.18

7.3

H2DBP

101

0.06

1.8

DBP-UiO

55.9

0.24

2.4

PpIX

26.6

0.19

1

如TEM所示（图1d），NMOF的形态没有改变，而高分辨率TEM图像以及它们的快速傅里叶变换模式表明保留了NMOF的结晶度（图S11）。经过孵育后，DBC-UiO的PXRD图案没有变化。而在RPMI 1640细胞培养基的培养结果（图1a），进一步证明了这一点——DBC-UiO在生物环境中的骨架稳定性。

DBC-UiO不仅保留了DBP-UiO的全部属性（包括晶体结构和稳定结构，即使在64％的PS负载下也能避免自淬灭的发生，增强了ISC以提高单线态氧的产生效率，并且具有多孔框架和纳米板形态以促进单线态氧的扩散）我们测试了DBC-Ui0对抗鼠和人结直肠癌的光动力治疗的功效。光动力疗法在临床上用于治疗结肠癌，通过内窥镜透射光来激活光敏剂，从而治疗结肠癌。也已知PDT治疗原发性结肠肿瘤可引起对转移性肿瘤的免疫原性应答。

评估NMOF的肿瘤细胞摄取的方法是通过在Hf4 下将CT26细胞与DBP-UiO或DBC-UiO一起孵育，浓度为50mu;M，持续4小时。再通过ICP-MS测定CT26细胞中Hf含量--分别为DBP-UiO（34.4plusmn;1.3 nmol / 106）和DBC-UiO（23.5plusmn;0.8 nmol / 106）细胞。通过UV-vis分析也可以确定CT26和HT29在配体浓度方面对DBC-U10和H₂DBC的细胞摄取（图S12和S13）。研究DBC-UiO对结肠癌细胞的体外光动力治疗的效率，并与DBP-UiO和相应的游离配体进行比较。将NMOF或游离配体与不同浓度的CT26或HT29细胞一起孵育，并用来自发光二极管（LED（DBPUiO和H₂DBP，640nm; DBC-UiO和H₂DBP，650nm）的光照射细胞，总光量为90J / cm2（0.1W / cm2 15分钟）。DBC-UiO通过在低NMOF和低剂量下有效杀死两种癌细胞系而优于DBP-UiO（图2a，b）。用游离配体治疗的组也显示出有中度的光动力治疗疗效，在黑暗或PBS对照组中而没有观察到细胞毒性。计算照射的CT26细胞中DBC-UiO，H₂DBC，DBP-UiO和H2DBP的IC50值分别为5.1plusmn;0.2,8.5plusmn;0.1,10.4plusmn;0.5和20.0plusmn;3.1mu;M，并且在HT29细胞中的IC50值照射计算分别为6.0plusmn;1.5,7.5plusmn;2.3,13.1plusmn;2.2和17.0plusmn;4.0mu;M。这些结果证实，DBC-UiO比DBP-UiO能更有效的增强光动力治疗的光物理特性。DBC-U10在鼠巨噬细胞Raw264.7细胞中表现出光动力治疗的细胞毒性，但需要更高的配体浓度（gt;20mu;M）才能达到50％的细胞杀伤（图S14）。

我们进一步显示细胞凋亡和免疫原性细胞死亡（ICD）有助于提高体外光动力治疗的疗效。将CT26细胞与5mu;MDBC-U10或H₂DBC温育，接着以0.1W / cm 2强度的光照射15分钟（90J / cm 2）。通过使用Alexa Fluor 488膜联蛋白V /死亡细胞凋亡试剂盒，进行流式细胞术测定光动力治疗诱导的细胞凋亡。在暗处用DBC-UiO或H₂DBC处理的细胞没并有观察到细胞凋亡或坏死，而在光照射下用DBCU10或H₂DBC处理时，显著数目的细胞发生了细胞凋亡（图2c和S15）这证明了这种材料只会在光激发下才能产生杀灭癌细胞的效果。钙网蛋白（CRT）是暴露于经历免疫原性细胞死亡的细胞表面上的生物标志物。通过流式细胞术和免疫荧光测定CRT表达能够评估由DBC-UiO诱导的光动力疗法所诱导的免疫原性细胞死亡。先用5mu;MDBC-UiO或H₂DBC处理CT26细胞，然后用0.1W / cm2的光照射15分钟（90J / cm2）。再将结果用流式细胞术分析，收集细胞并用Alexa Fluor 488-CRT抗体和碘化丙锭（PI）染色（图2D和S16）。染色的细胞的荧光强度被PI阴性细胞所门控。为了进行免疫染色分析，细胞用AlexaFluor 488-CRT和DAPI染色，并使用共焦激光扫描显微镜（CLSM）观察（图2e和S17）。在没有光照射的情况下用DBC-UiO或H₂DBC处理的细胞表面没有CRT表达，而在有光照射时在细胞表面能检测到显著量的CRT。这些结果表明免疫原性细胞死亡参与了DBC-UiO和H₂DBC 光动力治疗诱导的细胞毒性。

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