头孢拉定阻断太阳紫外线引起的皮肤炎症 通过直接抑制T-LAK细胞来源的蛋白激酶外文翻译资料

 2022-07-18 20:14:16

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头孢拉定阻断太阳紫外线引起的皮肤炎症

通过直接抑制T-LAK细胞来源的蛋白激酶

范晓明1，段秋红1，常熟科2，张桂萍3，胡娟娟1，吴丹1，曾晓宇1，陈静文4，郭金光4，周舟1，费实4，冯1 1

1华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系，武汉430030

2华中科技大学同济医院病理科，武汉430030

3上海比邑化学科技有限公司，上海201203，中国

4空军总医院皮肤科，北京，100142

*这些作者对这项工作做出了同样的贡献

通讯地址：周杰，电子邮箱：chentianyuzj@163.com

费时，电子邮箱：shf_1969@163.com

冯朱，电子邮件：fengzhu@hust.edu.cn

关键词：头孢拉定，TOPK，信号转导通路，太阳紫外线，皮肤炎症

收到日期：2015年11月16日接受日期：2016年3月07日发布日期：2016年3月22日

摘要

过度的太阳紫外线（SUV）引起的皮肤炎症和皮肤癌是对人类健康的重大威胁。 SUV通过激活p38丝裂原活化蛋白激酶（p38）和c-Jun N-丝氨酸激酶（JNKs）诱导皮肤炎症。 T-LAK细胞来源的蛋白激酶（TOPK）在这个过程中起着重要的作用。在此，临床数据显示TOPK，磷酸-p38，磷酸-JNK在人类日光皮炎中高度表达。体外研究表明，SUV以剂量和时间依赖性方式诱导HaCat和JB6细胞中p38和JNK的磷酸化。分子对接模型表明头孢拉定是一种FDA批准的头孢菌素抗生素，可直接与TOPK结合。体外结合试验的结果证实头孢拉定可以直接与TOPK结合。体外激酶结果显示头孢拉定可抑制TOPK活性。体外研究进一步表明头孢拉定以剂量和时间依赖性方式抑制SUV诱导的p38，JNKs和H2AX的磷酸化水平，头孢拉定抑制HaCaT和JB6细胞中IL6和TNF-alpha;的分泌。体内研究表明，头孢拉定下调SUV诱导p38，JNKs和H2AX的磷酸化，并抑制Babl / c小鼠中IL6和TNF-alpha;的分泌。这些结果表明头孢拉定可以通过阻断TOPK信号通路抑制SUV诱导的皮肤炎症，而TOPK是抑制SUV辐射诱导的炎症的有效靶点。

介绍

太阳紫外线（SUV）辐射包括UVA（315-400nm），UVB（280-315nm）和UVC（200-280

纳米）。所有的UVC，90％UVB和10％UVA辐射都被臭氧层吸收[1]。 UVA暴露导致氧化性DNA修饰，而UVB导致形成环丁烷嘧啶二聚体[2]。因此，UVA和UVB被认为是皮肤炎症和癌症的主要原因。 SUV包含约95％的UVA和5％的UVB。虽然许多途径已经使用纯UVA和UVB进行了研究

照射后，SUV引起的病理改变尚未充分了解足以预防和治疗疾病。 SUV诱导的氧化应激与皮肤的一些慢性炎症疾病有关，如日光性皮炎，牛皮癣和皮肤癌[3]。因此，抑制炎症信号通路是管理SUV诱导的皮肤病的有效策略。 p38和JNKs途径是转录和翻译水平上促炎细胞因子生物合成的关键调节因子[4-6]。而且，p38alpha;和JNKs可以在SUV辐射诱导的炎症中强烈激活[7]。

T-LAK细胞起源蛋白激酶（TOPK）是MEK3 / 6相关MAPKK家族的新成员，是p38和JNKs的上游激酶[8-9]。它涉及肿瘤细胞的有丝分裂检查点，DNA损伤，肿瘤转化和炎症[10]。以前的研究表明TOPK在紫外线诱导的DNA损伤反应过程中促成了p38激活和JNK磷酸化[9,11]。 TOPK可以在Ser139位点磷酸化H2AX，这通常被用作DNA损伤的生物标志物[12-13]。因此，TOPK可能是化疗或化学预防性化合物在SUV诱导的DNA损伤和皮肤炎症中的潜在靶标。

目前，只有两种TOPK抑制剂，HI032和OTS514被发现[14-15]。但是，这些化合物副作用很大，不能用于临床治疗疾病。在这项研究中，采用基于结构的虚拟配体筛选方法来筛查FDA批准的药物数据库。 FDA批准的第一代广谱头孢菌素抗生素头孢拉定是一种TOPK抑制剂，可抑制SUV引起的皮肤炎症。

结果

TOPK，p38和JNKs的磷酸化在人类日光皮炎中过度表达

SUV会对皮肤造成炎症和氧化损伤，从而导致晒伤，pho分化和光致癌作用[17]。先前对人和小鼠模型的研究表明晒伤早期凋亡，炎性细胞因子诱导和红斑在急性早期暴露于紫外线后最大，这些急性反应可能与未修复的DNA损伤有关[18]。在日光性皮炎发展成皮肤癌期间，SUV诱导的炎性微环境似乎是促进事件。收集8例阳光皮炎和6例正常皮肤样本。 H＆E结果显示日光性皮炎的角化过度，表皮厚度和炎性细胞浸润较正常皮肤高。 IHC结果显示日光性皮炎中磷酸化JNKs（图1B），磷酸化p38（图1C）和TOPK（图1D）的表达高于正常皮肤中的表达，并且数据总结在表1中。接下来，我们在体内和体外研究了TOPK信号传导途径与SUV诱导的皮炎之间的关系。 SUV在HaCat和JB6细胞中以剂量和时间依赖性方式诱导p38和JNKs的磷酸化p38和JNKs的活化是SUV辐射暴露后细胞应激的指示。首先，在HaCat和JB6细胞中检测p38和JNK的磷酸化水平。为了检测SUV可能刺激HaCat细胞应激反应的最佳剂量时间点，将细胞在不同时间暴露于不同剂量的SUV。结果表明，p38和JNKs的磷酸化水平以剂量和时间依赖性方式增加。例如，p38和JNK的磷酸化水平从10至50KJ / m2 SUV逐渐增加（图2A）。此外，在高剂量SUV（40KJ / m2）暴露后，磷酸化p38和磷酸化JNKs水平在5分钟时达到最高并且细胞维持健康状态（图2B）。在JB6细胞中观察到相似的结果，除了在暴露于30KJ / m 2 SUV后15分钟时磷酸-JNKs水平最高（图2C和2D）。因为p38激活是SUV诱导的炎症信号通路中的主要现象[11]，所以这两组细胞用40KJ / m2的SUV处理，在SUV照射后5分钟收集样品用于以下实验。时间点选择基于图2.TOPK敲低抑制SUV诱导的HaCat细胞中p38和JNKs的磷酸化以前的研究表明TOPK介导的UVB诱导的p38alpha;和JNKs活化[9,19]，因此TOPK敲低可能影响p38在长期生长因子刺激后激活并减少了MCF7细胞中紫外线照射后的DNA损伤应答[20]。将TOPK敲入HaCat细胞中，选择感染了shTOPK-2和shTOPK-5的稳定细胞系用于进一步实验（图3A）。与shMock细胞相比，shTOPK HaCat细胞中40KJ / m 2 SUV后p38和JNK的磷酸化水平显着降低（图3B）。因此，结果显示敲减TOPK抑制SUV诱导p38和JNKs的活性。头孢拉定直接与TOPK结合，并抑制TOPK活性体外激酶测定由于药物开发成本高，FDA批准的化合物的药物复位近年来有所增加。接下来，采用基于结构的虚拟筛选来鉴定TOPK抑制剂。 FDA批准的头孢拉定第一代广谱头孢菌素抗生素被确定为TOPK抑制剂候选药物中的第一位。为了估计头孢拉定是否与TOPK结合，应用同源建模和随后的分子对接方法。通过对接模拟产生的结合模型表明TOPK的ATP结合口袋能够容纳与铰链残基E100和G102形成两个潜在氢键的头孢拉定。头孢拉定的疏水部分插入疏水袋中，而亲水端留在溶液暴露的袋口处（图4A）。为了进一步评估该结合模型，使用具有纯化的TOPK蛋白和HaCat细胞裂解物的头孢拉定缀合的珠进行体外结合测定。在头孢拉定 - 缀合的珠子组中观察到代表TOPK的强带，而在珠子单独组中没有观察到明显的带（图4B）。这些结果表明头孢拉定可以直接与TOPK结合，表明头孢拉定可能抑制TOPK活性。为了证实这一假设，使用GST-H2AX作为底物，在0.5,1,2mM头孢拉定存在下用活性TOPK进行体外激酶测定。结果表明，随着头孢拉定预处理浓度的增加，HA2X的磷酸化水平逐渐降低（图4C）。接下来，通过MTS分析在HaCat和JB6细胞中评估头孢拉定的细胞毒性。在头孢拉定（0.04,0.5,1,2mM）存在下头孢拉定不降低细胞的生存能力24小时（图4D）。 H研究头孢拉定对小鼠中SUV诱导的皮肤炎症的影响，剪切成年Babl / c小鼠并用头孢拉定（100mg / kg）涂抹。三小时后，背部皮肤的无毛部分经受100KJ / m 2 SUV照射。在SUV照射后24小时，将所有动物给予安乐死并剥离背侧躯干皮肤用于H＆E和IHC染色和ELISA测定。

我们的数据显示，与正常对照组相比，100KJ / m 2 SUV中免疫细胞的浸润使表皮厚度显着增加（图7A上图：中间列与左侧列）。通过H＆E检测，与100mg / kg头孢拉定处理的小鼠的表皮厚度相比，SUV组也明显减少（图7A上图：右列对中间列），免疫细胞的浸润也减少。接下来，在皮肤样品的石蜡切片上测试TOPK下游底物。 SUV照射后p38，JNKs和H2AX的磷酸化水平显着增加，并且经IHC染色后头孢拉定处理后水平显着受到抑制（图7A）。通过对图7A中小鼠皮肤组织中磷酸化p38，磷酸化JNK和gamma;-H2AX的表达进行定量分析

与SUV组相比，用100mg / kg头孢拉定处理的p38，JNKs和H2AX的磷酸化表达分别显着地被抑制了82％，89％和72％（图7B，P lt;0.01）。此外，测试小鼠皮肤组织中由SUV诱导的炎性因子IL6和TNF-alpha;的分泌，以检查头孢拉定的作用。结果显示头孢拉定在体内抑制了SUV诱导的IL6和TNF-alpha;的分泌（图7C）。总之，这些数据表明，头孢拉定可以通过抑制TOPK信号通路在体内保护小鼠皮肤免受SUV照射引起的炎症反应。

讨论

SUV被认为是全球男性和女性表皮炎症发展的环境因素。最常见的症状是皮肤发炎和烧伤。在某些情况下，急性炎症以缓慢的过程促进慢性炎症，最终在几年内进化为皮肤癌[25]。大多数皮肤疾病与紫外线照射有关，如日光性皮炎，鱼鳞病，牛皮癣，光化性角化病和皮肤癌。

图4：头孢拉定与TOPK结合并抑制TOPK活性。 A.头孢拉定的对接模型和头孢拉定的化学结构。对接模型在“材料和方法”中进行了描述。 B.头孢拉定在体外和体外直接与TOPK结合。头孢拉定 - 琼脂糖4B或琼脂糖4B用于结合和下拉测定。 C.头孢拉定以剂量依赖性方式体外抑制TOPK活性。使用失活的GST-H2AX蛋白作为具有活性TOPK和100mu;MATP的底物。通过10％SDS-PAGE凝胶分离蛋白质并通过Western印迹检测。显示的直方图代表至少三个独立实验。星号（*）表示与TOPK激酶和H2AX底物组相比显着（P lt;0.05）差异（泳道3）。 D.头孢拉定对HaCat和JB6细胞的细胞活力没有影响。将HaCaT细胞和JB6细胞用0.04,0.5,1和2mM头孢拉定处理24小时，并根据制造商的说明使用MTS进行测量。测量细胞活力并以平均值plusmn;SEM表示至少三次独立实验。

丝裂原活化蛋白激酶样（MAPK样）蛋白激酶[26]。先前的研究表明TOPK在恶性黑色素瘤组织[27]和RPMI7951黑色素瘤细胞[12]中高度表达。 TOPK在日光性皮炎的临床样品中高度表达（图1D）。众所周知，MAPK如p38和JNKs是SUV诱导炎症的重要靶点

ERK1 / 2 [11]和NF-kB [21]的活性; TOPK可以磷酸化ERK1 / 2 [31]并激活NF-kB [32]。 TOPK是p38和JNK的上游激酶。在这项研究中，我们发现p38和JNK的磷酸化水平也在日光性皮炎中高度表达（图1C和1D）。因此，TOPK是SUV照射引起的皮肤炎性疾病治疗的理想靶点。

研究头孢拉定对小鼠中SUV诱导的皮肤炎症的影响，剪切成年Babl / c小鼠并用头孢拉定（100mg / kg）涂抹。三小时后，背部皮肤的无毛部分经受100KJ / m 2 SUV照射。在SUV照射后24小时，将所有动物给予安乐死并剥离背侧躯干皮肤用于H＆E和IHC染色和ELISA测定。

我们的数据显示，与正常对照组相比，100KJ / m 2 SUV中免疫细胞的浸润使表皮厚度显着增加（图7A上图：中间列与左侧列）。通过H＆E检测，与100mg / kg头孢拉定处理的小鼠的表皮厚度相比，SUV组也明显减少（图7A上图：右列对中间列），免疫细胞的浸润也减少。接下来，在皮肤样品的石蜡切片上测试TOPK下游底物。 SUV照射后p38，JNKs和H2AX的磷酸化水平显着增加，并且经IHC染色后头孢拉定处理后水平显着受到抑制（图7A）。通过对图7A中小鼠皮肤组织中磷酸化p38，磷酸化JNK和gamma;-H2AX的表达进行定量分析

与SUV组相比，用100mg / kg头孢拉定处理的p38，JNKs和H2AX的磷酸化表达分别显着地被抑制了82％，89％和72％（图7B，P lt;0.01）。此外，测试小鼠皮肤组织中由SUV诱导的炎性因子IL6和TNF-alpha;的分泌，以检查头孢拉定的作用。结果显示头孢拉定在体内抑制了SUV诱导的IL6和TNF-alpha;的分泌（图7C）。总之，这些数据表明，头孢拉定可以通过抑制TOPK信号通路在体内保护小鼠皮肤免受SUV照射引起的炎症反应。

然后与无血清的DMEM培养基一起孵育12小时，然后用0.5,1,2mM头孢拉定处理6小时。然后在用40KJ / m2 SUV处理后，将培养箱中的细胞更换5分钟。 C.和D. JB6在与HaCat细胞相同的条件下处理。显示的直方图代表至少三个独立实验。星号（*）表示与仅SUV组（第2道）相比显着（P lt;0.05）差异。 E.Hat和JB6细胞用2mM头孢拉定预处理6小时，并在饥饿24小时后用40KJ / m2 SUV刺激，并在24小时收集培养基。使用ELISA试剂盒测定IL6和TNF-alpha;的浓度。显示的值是来自三次独立实验的数据的平均SEM。星号（*）表示与对照组相比显着（P lt;0.05）差异。英镑（＃）显示与SU

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