用于定量药物制剂中左氧氟沙星的微生物生物测定的开发和验证外文翻译资料

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用于定量药物制剂中左氧氟沙星的微生物生物测定的开发和验证

1.介绍

左氧氟沙星是合成的氟喹诺酮类广谱抗生素，用于治疗对其他抗生素类别无效的严重细菌感染[1,2]。左氧氟沙星化学名(S)-(-)-9-氟-2,3-二氢-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧代-7H-吡啶并[1,2,3-de]-[1,4]苯并恶嗪-6-羧酸半水合物。化学式C₁₈H₂₀FN₃O₄ ，分子量370.4 [3]。它是一种淡黄色的白色至黄色粉末。

左氧氟沙星对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌均有活性[5]。 它用于治疗支气管炎，尿路感染，肺炎，皮肤和软组织感染[6]。这种抗生素也可用于预防吸入炭疽病后的感染。拓扑异构酶IV和DNA旋转酶是DNA复制、转录、修复和重组所必需的重要酶，左氧氟沙星抑制细菌拓扑异构酶II，从而抑制细胞分裂[6,7]。

在所有的医药产品中，最常见的假冒伪劣产品是抗生素，可能是因为它们的使用频率非常高[8]。滥用抗生素促进了抗生素耐药性的增加和传播，并可能导致双重感染[9]。开发耐药微生物菌株的一个重要因素是许多抗生素是抑菌而不是杀菌的[10]。为了克服抗性问题和抗生素的安全使用，正确测量抗生素的效力和生物活性是至关重要的。由于抗性问题增加，定量抗生素制剂中活性成分的实际浓度是至关重要的。抗生素制剂中活性成分浓度的轻微差异可能会影响实际疗效。因此，定量抗生素制剂中的活性药物成分（API）是非常必要的，因为大部分时间这些药物是将生命与死亡分开的线[11]。已知这些浓度很低的物质会完全破坏或部分抑制微生物[12]。

抗生素的效力可以通过化学和生物学方法来确定。 化学方法如毛细管电泳，紫外（UV）分光光度法，高效液相色谱法（HPLC）和高效薄层色谱法（HPTLC）已用于定量测定制剂中以及人尿液中的左氧氟沙星和血清[ 6，13]。 然而，在任何药典中尚未报道确定左氧氟沙星效力的微生物测定法。 生物学方法是确定抗生素效价最方便的方法[14]。

抗菌效力的测定对药物制剂的质量控制和质量保证至关重要，因此有必要开发实用和经济的方法，可用于药物的验证和剂量[15,16]。最近开发了用于静脉内施用抗生素的微生物测定法的应用。通过管理当局控制抗生素的效力，这种方法是高度可接受的[17,181]。微生物生物测定法在抗生素药物的生产和质量控制中发挥着重要作用，并且需要相当的技能和专业知识才能确保成功[18,191]。微生物检测有助于估计活性成分，生物活性和监测抗生素的稳定性。抗生素分子的任何微小变化（通过化学方法可能无法检测到）将通过抗微生物活性的变化来揭示[4]。因此，微生物测定法对于解决对抗生素及其制剂的效力可能变化的疑虑是非常有用的。微生物生物测定法需要有效且充分表征的微生物菌株。微生物菌株的鉴定和表征通过可培养和不可培养的技术进行[20,21]。

抗生素的效力可以通过微生物生物测定来测量，其中它们对测试微生物生长的抑制作用被评估。生物测定不需要专门的设备或有毒溶剂[23]。广泛用于抗生素测定的琼脂扩散方法将抑制区域的大小与测定的抗生素的剂量相关联。理论上已经考虑了在杯中应用的溶液中抑制区的直径与抗生素浓度的关系[24,251。抗生素的能力是抑制或杀死活微生物的生长。在标准化条件下抑制微生物生长可用于抗恶性肿瘤的治疗功效。使用枯草芽孢杆菌ATCC-6633 [26]测量左氧氟沙星在眼用溶液中的抗微生物活性。对234株结核分枝杆菌进行了左氧氟沙星的体外活性评估，MIC50和MIC90分别为0.25 mg / L和0.5 mg / L [27]。

该文章的重点是开发和验证一种简单，灵敏，准确，精确和具有成本效益的单层琼脂扩散（5 1）生物测定法，用于量化药物制剂中左氧氟沙星的效价和生物活性。

2.材料和方法

2.1化学品和试剂

所使用的化学品和试剂为分析级（Merck Ltd.，Mumbai）。 使用Milli-Q水（Millipore）制备溶液。 使用左氧氟沙星的美国药典（USP）参考标准用于标准溶液制备。 含有左氧氟沙星500mg的商品样品左旋氧氟沙星片剂从当地市场获得。

2.2设备

所有用于生物测定研究的设备都经过校准和验证。 灭菌玻璃器皿（B类），如培养皿，试管，容量瓶，移液器和无菌螟虫在实验中使用。 蒸汽灭菌器/高压灭菌器（Make-Nat钢）用于在121℃和15psi下灭菌培养基15分钟。 在-80℃储存的微生物培养物的甘油储备物使用深度冷冻机（Make Haier）作为测试菌株。 通过FTIR分光镜（Perkin Elmer）进行左氧氟沙星的鉴定，使用HPLC（Make-Agilent Technologies）进行比较研究。 将生物测定板在培养箱（Make-Thermolab）内37℃孵育以用于细菌生长。 通过抗生素区阅读器（Make-Aarachal Corporation）测量抑制区。

2.3 测试微生物菌株

微生物培养物购自美国的美国典型培养物保藏中心（ATCC）和英国的国家典型培养物保藏中心（NCTC）。 将不同的革兰氏阳性细菌蜡状芽孢杆菌（ATCC-11778），短小芽孢杆菌（ATCC-14884），枯草芽孢杆菌（ATCC-6633），金黄色葡萄球菌（ATCC-6538,29737,9144），表皮葡萄球菌（ATCC-12228），Kocuria rhizophila（ATCC-9341），藤黄微球菌（ATCC10240）和革兰氏阴性菌大肠杆菌（ATCC-

（ATCC-25619,9027），肺炎克雷伯氏菌（ATCC10031），支气管炎博德特氏菌（ATCC-4617）用于微生物生物测定。

2.4制备磷酸盐缓冲液

pH对抗生素对指示微生物的响应具有主要影响。 实验用不同的pH缓冲液进行。 通过将各种量的K 2 HPO 4和KH 2 PO 4溶解在足够的Milli-Q水中来制备不同pH的缓冲溶液。 用8M磷酸或10M氢氧化钾调节pH并在高压灭菌器中灭菌[3]。

2.5微生物培养基的制备

脱水介质购自印度孟买的Hi-Media有限公司。 媒体的主要目标是支持生物测定中使用的指示微生物的快速增长。使用抗生素测定培养基No.11作为生物测定介质来制备基底层和种子层。Soyabean酪蛋白消化琼脂培养基用于斜面制备细菌生长。将脱水培养基溶解在蒸馏水中，按照脱水培养基容器上的说明调节pH值。培养基在121℃和15psi的高压灭菌器中灭菌15分钟。

2.6标准溶液的制备

将准确称取的左氧氟沙星参考标准量25.0 mg溶于磷酸盐缓冲液中，直至体积为25 mL，得到1000 gg / mL左氧氟沙星。制备5个标准稀释液，即“S1（2.56gg / mL），S2（3.20gg / mL），S3（4.00gg / mL），S4（5.00gg / mL）和S5（6.25gg / mL） 逐步增加4：5的浓度。稀释S3被认为是标准的参考浓度（平均浓度）水平。

2.7样品溶液的制备

将二十片称重并粉碎。准确称量相当于25.0mg市售样品左旋泊洛芬片的粉末量并将其转移至25mL容量瓶中。用磷酸盐缓冲液将最终体积补足至25mL以获得1000mu;g/ mL的浓度。 从该原液制备浓度为100mu;g/ mL的溶液，最后进行稀释，即“T”，其等于平均参考标准浓度（S3）。

2.8接种物的准备和标准化

生物测定需要有效且充分表征的微生物菌株。 保存在甘油储备上的新鲜微生物苏氨酸被复活，然后在大豆酪蛋白消化琼脂培养基的斜面上进行亚培养。 将平板在37℃温育24小时以用于细菌生长。在整个研究中使用新鲜培养物斜面。 使用约3mL无菌盐水溶液（0.9％）从琼脂斜面洗涤微生物，然后测定稀释因子，其在约530nm处获得25％的透光率。

2.9生物测定法

标准曲线的5 1生物测定设计通过圆盘法进行。该方法取决于抗生素溶液从垂直圆柱体或空腔通过Petri板中的固化琼脂层扩散到一定程度，以使得添加的微生物的生长完全防止在圆柱体或腔体周围的区域中，该区域含有抗生素标准微生物悬浮液通过倾倒4mL用于制备测定培养基No.11的双层平板。种子层（用所需菌株接种）置于100mmtimes;20mm培养皿[4]中的固化的21mL测定培养基基层上。将这些板静置30分钟以固化。培养基凝固后，对5 1生物测定设计，在6个点上钻5mm直径的孔（图2）。将每种标准或测试溶液的100mu;L移液到单独的孔中。为了测试参考浓度（S3），伴随着每种标准或样品浓度，使用5个培养皿进行每个测定。将板在室温下放置1-4小时，作为预孵育扩散的时期以使不同溶液的应用之间的时间变化的影响最小化。将平板在37℃温育24小时。

完全潜伏期后，通过区域读数器准确测量抑制区域的直径（以mm计）并观察结果。测定板一式三份进行测试，得到标准S1，S2，S4和ss中的每一个以及测试样品“T”的九个测量值。为了适合所有培养皿中获得的数据，将参考浓度“S3”用最低和最高浓度的标准物测试36次，并且用测试样品测试9次。估计溶液“S3”的所有读数的平均值和三组平板上测试的浓度的读数以及“S3”的所有36个读数的平均值。解决方案“S3”的36个读数的平均值是曲线的校正点。通过以下等式获得用于最终效力计算的最高和最低区直径：

其中L是标准曲线响应线最低浓度的区域直径; H是标准曲线响应线最高浓度的区域直径; c是参考点标准溶液36个读数的平均区域直径; a，b，d和e是其他标准溶液的校正平均值，从最低到最高浓度。

2.10 FTIR光谱分析

傅里叶变换红外（FTIR）分析用于确定市售片剂样品（Levoflox）中是否存在左氧氟沙星。使用Perkin Elmer系统（Modal-Spectrum one）通过FTIR光谱法鉴定左氧氟沙星。商业样品（Levoflox）和参考标准制备成分散在溴化钾（IR等级）中的圆盘形式，并且在相同的操作条件下在2000和400之间记录光谱。

图2单层琼脂扩散生物测定法（5 1测定法）：5个培养皿代表参比溶液S1（2.56mu;g/ mL），S2（3.20mu;g/ mL），S3（4.0mu;g/ mL），S4（5.0mu;g/ pg / mL）和ss（6.25mu;g/ mL）。 #39;T#39;代表样品溶液（4.0 gg / mL）。

2.11。 HPLC测定

所建议的生物测定法的特异性与HPLC相比较。HPLC分析是在Agilent Technologies 1200系列上进行的，该系统由一个四元泵，一个自动进样器，一个光电二极管阵列检测器（DAD）和EZ Chrome Elite软件组成。所使用的柱子是来自ThermoElecuuml;？on Corporation的Cosmosil C18 MS Il。流动相由85体积的通过溶解84体积0.05M柠檬酸一水合物和1体积1M乙酸铵制备的缓冲溶液的混合物组成;和15卷乙腈。在0.1M盐酸中制备0.1％（m / v）左氧氟沙星参考标准溶液，并将5mL该溶液用蒸馏水稀释至50mL。试验溶液通过溶解含有100mg市售样品Levoflox片剂并分散在100.0mL 0.1M盐酸中的量来制备。用蒸馏水将5mL dlis溶液稀释至50mL。注射前所有溶液经0.45mu;m膜过滤器过滤。分光光度计设定在293nm。流速维持在100毫升/分钟，进样量为10微升。

3.结果

3.1 选择重要的微生物菌株

选择重要微生物的标准是在抗生素处理下具有明确的边缘和大的可测量的区域直径。 测试了16种细菌菌株对左氧氟沙星的反应和易感性。在所有测试菌株中，短小芽孢杆菌ATCC-14884在相同条件下显示最显着的结果。因此，短小芽孢杆菌ATCC-14884菌株进一步用于一级（5 1）生物测定研究。

3.2 pH对区

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