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从甜菊糖苷中使用来自硫磺矿硫化叶菌的beta;-糖苷酶生产甜菊醇
关键字：
beta;-糖苷酶;硫矿硫化叶菌;甜菊糖;甜菊醇优化
缩略语：
Ste，甜菊糖； SSbgly,来自硫磺矿硫化叶菌的 beta;-糖苷酶；RSM，响应面方法学； oNPGal, 邻硝基苯基-beta;-半乳糖苷；pNPGlc ,p-硝基苯基-beta;-Ｄ-葡萄糖苷；Ru,红宝石苷; Reb A, 莱鲍迪苷A
摘要：
甜菊醇是从甜叶菊植物中分离出来的一种二萜，它通过刺激胰岛 beta;-细胞的胰岛素分泌而具有作为降血糖药的潜在作用，并且也具有减少阴离子药物及其代谢产物在肾脏中清除的显著潜力。在这项研究中，使用乳糖作为诱导剂，LacS基因在极热嗜酸古细菌硫矿硫化叶菌中编码了热稳定的 beta;-糖苷酶（SSbgly），并在大肠杆菌 Rossetta BL21（DE3）pLyS中表达并克隆。通过发酵，SSbgly被表达为一种 61 kDa的蛋白，用10 mM乳糖诱导 18小时后，其酶活达到 24.3 U/mg，OD600达到 23。通过Ni-Sepharose层析获得纯化的蛋白，其产率为 92.3％。SSbgly水解甜菊糖苷以产生甜菊醇，产率为 99.2％。通过响应面法测定，在 75℃下，甜菊醇生产的最佳条件是 50 U/ml SSbgly 90 mg/ml 甜菊糖。
介绍
甜菊糖（Ste，13–O-beta;-槐糖基-19-O-beta;-D-葡萄糖基-甜菊醇）是一种非热量的天然甜味剂，从甜叶菊的叶子中分离出来。它比蔗糖甜 200倍。因此，它是各种食品中流行的糖替代品，在日本，中国，韩国和台湾经常用作食品补充剂。甜菊糖可以被降解为甜菊醇[（5beta;，8a，9beta;，10a，13a）-13-hydroxykaur-16-en-18-oic acid] ，是一种糖苷配基，通过肠道菌群在包括人体在内的其他多种动物中被发现。甜菊糖是一个大的中性分子，既有极性区域又有疏水区域，而甜菊醇含有一个疏水环，在羧基上带有一个负电荷。两种化合物均已被提出可以通过刺激胰腺 beta;-细胞分泌胰岛素，从而具有潜在的降糖药作用。但甜菊糖不能有效地被吸收到大鼠肠的外翻囊中，而甜菊醇却可以被快速地吸收。已显示甜菊醇抑制大鼠肾皮质切片以及人类有机阴离子转运蛋白1和3中 p-氨基马尿酸盐的积累，因此具有显着降低阴离子药物及其代谢产物在肾脏中的清除的潜力。甜菊醇在自然界中是罕见的，因此为了生产甜菊醇，使用了一种在极端酸性条件下水解甜菊糖的化学方法；但是，以这种方式生产的甜菊醇会自动重新排列成异雌醇。所以用高碘酸钠处理，还使用了氢氧化钠，但是此过程需要高度稀释的系统和大量过量的昂贵的高碘酸钠才能获得有用的产量。据报道，有人采用果胶酶或枯草青霉中的beta;-葡萄糖苷酶的酶促方法，但该方法需要较长时间（7天），甜菊糖到甜菊醇的转化率仅有 5.2％至 63.9％。此外，还报道了，来自硫矿硫化叶菌的突变体 beta;-半乳糖苷酶可有效地将甜菊糖水解为甜菊醇。来自超嗜热细菌的 beta;-糖苷酶，硫磺矿硫化叶菌是在火山温泉中生长，以 75–80℃为最佳生长温度，是最热稳定的糖基水解酶之一。另外，它还提供alpha;-半乳糖苷酶，alpha;-木糖苷酶和alpha;-葡糖苷酶的活性。因此，这种beta;-糖苷酶已被用于植物化学物质的水解，例如人参皂苷，异黄酮苷或半乳糖寡糖和乳果糖的合成。最近，据报道称来自 硫磺矿硫化叶菌的突变体 beta;-半乳糖苷酶在 80℃上，能将低浓度的甜菊糖完全水解为甜菊醇。与野生型酶相比，该突变酶的半乳糖寡糖产量更高。因此，与beta;-半乳糖苷酶相比，beta;-葡糖苷酶的相对活性仅为 4.0％。由于甜菊糖具有三个beta;-糖苷键，必须水解后才能释放出甜菊醇，因此水解酶需要很高的 beta;-葡糖苷酶活性。相对于 beta;-葡萄糖苷酶活性，随着反应温度从 50℃升高到 75℃，野生型糖苷酶的 beta;-半乳糖苷酶活性在 60％到 100％之间变化。Pisani等人报告说葡萄糖是竞争型抗SSbgly的抑制剂。
minus;
响应面方法学（RSM）是一种用于对多个变量进行建模和优化的统计技术，它通过在顺序测试程序中将实验设计与通过一阶或二阶多项式方程式进行插值相结合来确定最佳工艺条件。该方法已用于其他研究中，成功发现几种底物的最佳酶促水解方式。
因此，在本研究中，我们选择使用具有高 beta;-葡糖苷酶活性的野生型 beta;-糖苷酶来水解甜菊糖中的三个 beta;-糖苷键以生产甜菊醇。在本文中，我们在大肠杆菌中过量表达了来自硫磺矿硫化叶菌野生型 beta;-糖苷酶,并使用乳糖作为诱导剂，并使用响应面法（RSM）程序确定了使甜菊醇产量最大化的最佳甜菊糖浓度，反应温度和酶量。
表格1
在大肠杆菌中表达SSbgly并纯化。
|
步骤 |
净化过程 |
总容积 |
酵素 |
总活动 |
总蛋白质 |
具体酶活 |
净化 |
收益率（％） |
|
（毫升） |
活性 U/ml） |
（U） |
（毫克） |
（U/毫克） |
倍数 |
|||
|
1 |
粗酶 |
11.0 |
58.4 |
642.4 |
26.5 |
24.2 |
1 |
100 |
|
2 |
热处理 |
9.1 |
67.2 |
611.5 |
9.9 |
61.8 |
2.5 |
95.2 |
|
3 |
镍-琼脂糖亲和色谱 |
6.0 |
98.7 |
592.2 |
6.9 |
85.8 |
3.6 |
92.2 |
a使用在 20 mM bis-Tris缓冲液（pH 6.0）中的 200 mM乳糖和 10％（v/v）的酶在 80℃的中测定1–30分钟，测定SSbgly活性。一单位（U）的半乳糖苷酶或葡萄糖苷酶的活力定义为在上述反应条件下每分钟释放 1 micro;mol半乳糖或葡萄糖所需的酶量。
材料和方法
2.1.糖苷酶的制备
通过定制的基因合成服务（GenScript，Piscataway，NJ，美国）（图S1）构建了来自硫磺矿硫化叶菌（氨基酸残基1-489，GenBank登录号M34696）的编码beta;-糖苷酶（SSbgly）的基因。将合成的cDNA插入 pET28a（Novagen，Darmstadt，德国）中,表达在N端和C端区域带有多组氨酸标签的 SSbgly，并转化到大肠杆菌 Rosetta BL21（DE3）pPlyS中。为了进行小规模表达，细胞在100 ml LB培养基中生长，该培养基含有 0.5％（w/v）酵母提取物，1.0％（w/v）胰蛋白, 1.0％（w/v）NaCl和 0.5％（w/v）甘油（LB-甘油），并在 500毫升烧瓶中于 37 ℃条件下补充卡那霉素（50 micro;g/ml），并用0.1 mM异丙基beta;-d-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）或 10 mM乳糖诱导当在 28 ℃摇动时光密度达到 0.5时。16小时后收获细胞。将细胞重悬于 20 mM bis-Tris缓冲液（pH 6.0）中，然后通过超声裂解，离心（12,000 times;g 30分钟）后，检查澄清的细胞裂解液在以 200 mM乳糖为底物80℃下30分钟的酶活性。SSbgly的大规模表达是在装有3.5升LB甘油的7升发酵罐（韩国京畿道Biotron）中进行的。发酵条件为37℃，350 rpm，通气率为2 vvm。使细胞在 37℃上生长直至 OD600达到 0.5，此时在 28℃处添加 10 mM乳糖，并在 24小时后收获细胞。将细胞悬浮在20 mM bis-Tris缓冲液（pH 6.0）中并通过超声处理裂解，然后将 11 ml细胞裂解物在 80℃加热10分钟，然后在 4℃下以12,000 times;g离心 20分钟。将热处理后获得的上清液加载到 5 ml的Ni-Sepharose树脂（英国白金汉郡GE Healthcare）上。用 20 mM Tris（pH 7.5），0.3 M咪唑和 0.2 M NaCl从柱子上洗脱蛋白。合并含有纯蛋白的级分，浓缩，并针对 20 mM bis-Tris缓冲液（pH 6.0）进行透析。以结晶牛血清白蛋白（Sigma–Aldrich）为标准测定蛋白质浓度。
times;
SSbgly活性的测定方法是使用 200 mM乳糖，邻硝基苯基-beta;-半乳糖苷（oNPGal）和 p-硝基苯基-beta;-Ｄ-葡萄糖苷（pNPGlc）作为底物，其中含有 6.84 mu;g的酶在 20 mM bis-Tris缓冲液（pH 6.0）上维持 80℃ 1–30分钟。将酶反应后的样品点在硅胶 60F254板上（Merck，达姆施塔特，德国），并用两升乙腈：水[85:15（v/v）]显影。通过将TLC板浸入含有 0.5％（w/v）N-（1-萘）乙二胺二盐酸盐和 5％（w/v）硫酸的甲醇检测溶液中，并在 120℃加热 10分钟，碳水化合物将被可视化（图S2）。使用具有一套葡萄糖标准的 AlphaEaseFC 4.0图像程序（Alpha Inotech，San Leandro，CA，美国）分析反应中释放的葡萄糖量。SSbgly活性的一个单位定义为在 80℃下每分钟产生 1 micro; mol葡萄糖所需的酶量。要测定SSbgly的动力学参数，可使用 0.5-50 mM乳糖测定10分钟。在此时间范围内，反应响应是线性的。使用葡萄糖氧化酶试剂盒（韩国安山市）分析释放的葡萄糖。使用SigmaPlot程序（SPSS，美国加利福尼亚州圣地亚哥），根据双倒数作图法计算出米氏常数常数（Km）。
minus;
使用 2.5 mM oNPGal和pNPGlc作为底物，确定了beta;-糖苷酶(SSbgly)的beta;-半乳糖苷酶和 beta;-葡糖苷酶活性。分别在80℃和 20 mM bis-Tris缓冲液（pH 6.0）中用 6.84 micro;g酶反应 1–30分钟并用 Na2CO3（1M）灭活。410 nm处吸光度的增加是由于邻硝基苯酚或测量对-硝基苯酚以分别计算半乳糖苷酶或葡糖苷酶活性。一单位（U）的半乳糖苷酶或葡糖苷酶活性定义为在上述反应条件下每分钟分别释放1个micro;mol邻硝基苯酚或 p-硝基苯酚所需的酶量。beta;-糖苷酶（SSbgly)的beta;-半乳糖苷酶或beta;-葡萄糖苷酶活性的动力学参数分别使用 0.05 - 5.0 mM oNPGal或pNPGlc分别测定 6分钟和10分钟。在此范围内，反应响应是线性的,使用SigmaPlot程序（SPSS，美国加利福尼亚州圣地亚哥）从双倒数作图法可计算出米氏常数常数（Km）。
minus;
表2
具有不同底物的SSbgly的表观动力学表征。
|
基质 |
Km（mM） |
k cat（s-1) |
kcat / Km（s-1 mM-1） |
|
oNPGal |
2.25 |
24.0 |
10.67 |
|
pNPGlc |
2.04 |
38.65 |
18.95 |
|
乳糖 |
15.82 |
8.37 |
0.53 |
|
甜菊糖 |
17.21 |
1.62 |
0.094 |
2.2.用SSbgly从红景天苷，甜菊糖和莱鲍迪苷A生产甜菊醇
对重组 SSbgly进行了将红宝石苷（Ru），甜菊糖和莱鲍迪苷A（RebA）转化为甜菊醇的能力的测试。红宝石苷是按照我们以前的报告中所准备的制备的，甜菊糖（ge; 95％）和莱鲍迪苷（ge; 95％）由大坪公司（韩国京畿道）提供。使SSbgly（150 U/ml beta;-葡萄糖苷酶活性）与 10％（w/v）的红宝石苷，甜菊糖或莱鲍迪苷在
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