ATP与必要的组胺酸激酶Walk（YycG）结构域形成稳定的复合物外文翻译资料

 2022-08-08 03:08

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ATP与必要的组胺酸激酶Walk（YycG）结构域形成稳定的复合物

在枯草芽孢杆菌中， WalRK（YycFG）双组分系统协调细胞壁合成和细胞分裂。它调节在细胞壁重塑中起作用的自溶酶的表达和调节自溶酶活性的蛋白。转录因子WaIR被组氨酸激酶WaIK（一种多结构域同型二聚体）磷酸化后激活。它通过将gamma;-磷酸从ATP转移到ATP结合域上，自磷酸化其中一个组氨酸残基。这里，以１.６１Aring;的分辨率展示了Walk与ATP复合物的ATP结合域的高分辨率晶体结构。结合的ATP在晶格中保持完整。强的结合作用和结合袋的性质有助于其稳定性。ATP的三个磷酸部分包裹着一个Mg２＋离子，提供三个O原子在一个几乎理想的八面体结构进行配位。ATP分子也与蛋白质有很强的相互作用。另外，糖环的外环O３｀与beta;－磷酸盐的O２B之间有短暂的接触，暗示内部存在氢键。WaIK－ATP复合物在晶格中的稳定性表明，这种复合物可存在于体内，准备启动信号传输。因此，这一特征可能是传感机制的一部分，通过这种机制，当细胞遇到有利于生长的条件时，沃克双组分系统被如此迅速的激活。

1.介绍

WaIRK（YycFG）双组分系统（TCS）是在细菌中发现的少数几种必需的TCS之一。主要分布于厚壁菌门和一些梭菌门，在绝大多数细菌中，它总是存在于与walT（yycJ），walH和walI（yycH和yycI）一起的操纵子中（综述见Dubrac et al.， 2008）。WalRK通过调节自溶酶和调节自溶酶活性的蛋白的表达来控制细胞壁代谢（Ahn amp; Burne, 2007;Bisicchia等，2007;Dubrac等人，2007;Dubrac amp; Msadek, 2004;Howell等人，2003;Liu等，2006;Ng等，2003,2005）。当WalRK是活性的，这些自溶素主要在枯草芽孢杆菌的指数生长过程中对菌壁素的合成起作用（Bisicchia et al.， 2007;Howell等人，2003年）。WalK激酶定位于指数增长细胞的分裂体，这一过程需要PAS（Per－Arnt－Sim）域。激活信号来自于它与该位置的蛋白子的关联（图1;福岛等，2008年，2011）。辅助的WalH和WalI蛋白通过其跨膜结构域与WalK跨膜结构域的相互作用对WalK激酶活性产生负面影响。这些辅助蛋白并不定位于隔膜，并被认为抑制非分裂细胞中的WalK激酶活性（Szurmant et al.， 2008）。WalJ蛋白是beta;－内酰胺酶蛋白家族成员，已被证明在细胞壁代谢，协调细胞分裂和DNA复制中发挥作用（Biller等，2011）。因此，WalRK TCS及其相关的WalH，Wall和WalJ蛋白发挥协调细胞壁代谢和细胞分裂的功能。WalK活动是细胞分裂状态的指示器，通过其同源的WalR反应调节因子的磷酸化，WalK引导自溶和其他髓膜蛋白合成活性在与细胞需求相称的水平上表达。

图1

WalK激酶的结构域组织和WalK双组分系统中蛋白质的细胞位置(Fabret amp; Hoch, 1998)。

WalK是一种跨膜组氨酸激酶，由611个残基和两个跨膜结构域组成，这些结构域位于细胞外环结构域的两侧，参与信号检测(SD;氨基酸34 - 183)。细胞质区域包含一个HAMP(组氨酸激酶，腺苷酰基环化酶，甲基-接受蛋白和其他原核信号蛋白)结构域(184-253)，一个PAS (Per-Arnt-Sim)结构域(263-329)和一个自激酶结构域(376 - 611)。自激酶结构域由磷酸转移酶二聚亚结构域(DPT;376-443)包含磷酸化位点和ATP结合亚结构域(488-611)。辅助蛋白WalI和WalH位于细胞质膜上，在那里它们与WalK激酶的跨膜结构域相互作用，而WalJ是位于细胞质上的beta;-内酰胺酶型蛋白。反应调节因子WalR与DPT子域相互作用，交换磷酸化基团。

表1

WalK451的数据收集和细化统计信息。

括号中的值是最高分辨率的外壳(1.66-1.61Aring;)。衍射数据是由斯坦福同步辐射光源的射线9-1上的PILATUS 6M探测器在100 K下采集的。使用XDS软件包减少数据(Kabsch, 2010)。

walk是TCSs的EnvZ/OmpR家族成员，walker TCS及其相关蛋白的几种结构已经建立。

WalRK是TCSs和EnvZ/OmpR家族的成员，在厚壁菌门中高度保守。WalRK TCS及其相关蛋白的几种结构已经建立。枯草芽孢杆菌WalR的DNA结合域具有翼螺旋-螺旋-螺旋结构似于PhoB和观察到的相似之处一致在枯草芽孢杆菌的WalRK和PhoPR TCSs之间 (Bisicchia等,2010;Howell等人，2006;Okajima等，2008;陈等。2007)。WalR的alpha;2-alpha;3结构域比PhoB大，被认为与RNA聚合酶的sigma因子相互作用。Bent等人(2004)建立了肺炎链球菌的RR02 (WalR同源物)的接收器结构域，表明它与响应调节器的OmpR/PhoB家族的接收器结构域相似。已经建立了WalH和WalI结构，并提出了它们的跨膜域和WalK之间相互作用的模型 (Santelli et al. 2007: Szurmant et al. 2006, 2008)。

作为我们对Walk TCS的结构特征程序的一部分，我们在这里报告了WalK的ATP结合域(WalK451;残留物451-611)使用1.61 Aring;分辨率衍射数据。ATP结合域也被称为催化ATP结合(CA或cat)域(Dutta amp; Inouye, 2000)。我们把这个域简单地称为ATP域。

图2

WalK451的晶体结构。(a)描绘了与ATP复合的行走ATP结构域的立体图。域采用alpha;/beta;三明治式折叠，下层由一条由5条beta;股(绿色)组成的beta;片构成，标记为1、2、3、5、4，上层由三条alpha;螺旋(红色)组成，标记为alpha;1、alpha;2、alpha;3。循环区域以灰色显示。蓝色显示的是一个大的柔性环(残基Glu534-Gly567)，称为ATP盖子。三个缺失的残基(Thr558-Lys560)用虚线表示。ATP显示为球棍模型。一个Mg2 离子(青色)与ATP协调。三个残基的侧链，使突出的相互作用与ATP也显示在球和棒的表现。Asn503参与Mg2 协调。Asp533与腺嘌呤环形成氢键。Tyr507的芳香侧链靠近腺嘌呤环。第二个Mg2 离子位于螺旋alpha;3的c端附近。这种离子位于晶体学的双对称轴上，并连接晶格中相邻的两个蛋白质分子。阳离子由三个水分子配位，三个水分子与一个蛋白质分子相互作用，它们的对称等价于与另一个分子相互作用。因此，该Mg2 离子在晶体充填中起作用。这个图是用BobScripi程序制作的(Esnouf, 1997)。(b) 2FO- FC图，显示ATP和Mg2 离子的电子密度。等高线绘制在3.0sigma;水平。gamma;-磷酸盐的密度与alpha;-磷酸盐或beta;-磷酸盐的密度一样高。O原子用红色表示，N原子用蓝色表示，P原子用黄色表示，Mg原子用洋红色表示。该图是使用PyMOL (http://www.pymol.org)

2. 实验

2.1蛋白表达和纯化

用引物YycG_451扩增WalK的ATP域(5-GGGAATTCCATATGtggattcagattgtccggtttatc -3)和YycG_RKI (5-GGGAATTCCATATGtggattcagattgtccggtttatg-3”)使用染色体DNA作为模板。扩增的DNA片段(527 bp)和pET21b表达载体分别用Xhol和Ndel酶切，连接转化大肠杆菌TG1。从转化子中分离到质粒HA110，并对编码WalK451的DNA插入物进行测序验证。将质粒HA110转化大肠杆菌表达株BL21 (DE3)，得到菌株HA80。如前所述，WalK451蛋白的表达和纯化(Howell et al, 2006)。纯化后的蛋白被透析并保存在含有甘油的缓冲液中[20 mM TrisHCI pH 8, 0.3 M NaCI, 50% (wl)甘油]。

2.2结晶和数据收集

WalK451-ATP复合物的结晶是用挂滴汽扩散技术生长的。将7 mg ml-l的蛋白原液配制成由10 mM Tris-HCI、100 mM NaCl、5%甘油和1.5 mM NaN3组成的溶液，pH 7.5。用1 M Tris-HCI pH9配制100mu;l ATP原液，浓度为500 mM。由于ATP具有很强的酸性，将所需的ATP溶解于1 M的Tris-HCI pH9中，ATP溶液的最终pH值为6.5。ATP原液与蛋白质原液混合，最终浓度为10mM。随后加入1 M MgCl2到蛋白质-ATP混合物使其浓度为40mM。得到了晶体从2lmu; 蛋白质-ATP-MgCl2混合物和1微升储液(80mM酒石酸氢铵和8%聚乙二醇3350 pH值6.5)。在287K的培养箱中，晶体在大约三周内生长到平均尺寸为0.2 x 0.3 x 0.5 mm。本实验室采用RU-H3R/R-AXIS IV 系统采集初始数据，分辨率为2.8Aring;;随后在斯坦福同步辐射光源收集高分辨率数据(1.61 Aring;)(表1)。

2.3结构解决和改进

利用HK853的ATP域分子置换技术解决了该结构(Marina et al.， 2005;PDB条目2c2a)作为程序CNS的搜索模型(Brunger et al.， 1998)。模型建立使用程序O (Jones et al.， 1991)。在使用REFMACS（Murshudov et al.， 2011)程序进行了几次模型构建和细化后，该结构细化最终的R和Rfree分别达到了20.7%和23.4%。表1提供了数据收集和细化统计信息。

3.结果

3.1结构描述

最终的模型包括145个蛋白质残基，一个ATP分子，115个水分子和两个Mg2 离子。一个环的两个残基(472和473)、另一个环的6个残基(555-560)和分子c端的9个残基(603-611)在电子密度图上都不可见。该蛋白序列在c端有另外15个残基，构成TEV蛋白酶位点和六组氨酸标签，但这些残基也没有定位。图2(a)描绘了WalK ATP域(WalK451)的带状表示。对WalK451和搜索模型HK853的序列进行比较，发现两者之间有38%的序列一致性。两个构造的整体褶皱相似，但在连接环区域有较大的变化。该结构是由一个双层alpha;/beta;三明治折叠，在顶部有一个大的ATP口袋。底层是由五个beta;链组成的beta;-薄片。第1股和第2股平行运行，而第2，3，5和4方向交替。最上面的一层由三个alpha;螺旋组成。有一个大的柔性环(Asp534-Gly567)，它包含一个短的螺旋段，对ATP的结合至关重要。这个区域在与ATP结合后会发生主要的构象变化，被称为ATP盖(Dutta amp; Inouye, 2000)。蛋白质折叠是组氨酸激酶ATP结构域的特征，与哺乳动物ATP结合结构域的折叠无关(Tanaka et al, 1998)。这种特殊的折叠被称为Bergerat折叠，在另外三个看似无关的家族中发现，即gyrase、Hsp90和MutL (Dutta amp; Inouye，2000;Gao等人，2007)。在传统的NTPase结构域中，中间的beta;薄片被夹在两层alpha;螺旋之间，不像Bergerat折叠只有两层。ATP分子与蛋白质紧密结合，如ATP强电子密度所示(图2b)。ATP分子参与与蛋白质分子、溶剂分子和Mg2 离子的几种相互作用。除了与蛋白质分子直接相互作用外，它还通过Mg2 离子与一些溶剂分子进行桥接作用。ATP的各种相互作用，从镁配位开始，将在下面讨论。

3.2ATP和Mg2 配位

ATP的三磷酸部分贡献了6个氧原子中的3个与Mg2 离子配合。O原子O1A,O1B和O1G分别与三个P原子PA,PB和PG配位 (图3a)。此外，两个水分子和Asn503的侧链O原子OD1也与镁配位，具有近乎理想的配位几何结构。

图3

Mg2 配合ATP (WalK)。(a) ATP与环境的相互作用。镁离子由6个O原子配位(用粗红线表示)。三磷酸盐的3个O原子、2个水分子和Asn503的侧链O原子以八面体几何构型与镁配位，配位距离接近2.0 Aring; (1.9-2.1 Aring;)。氢键用虚线表示。除了与镁配位外，Asn503的侧链还与三磷酸基形成氢键相互作用。Asp533与腺嘌呤环上的N6直接形成氢键。Tyr507堆积在腺嘌呤环附近，并与一个磷酸O原子形成一个弱氢键(图中未显示)。此外，Gly565、Leu566、Gly567和Leu568的主链酰胺(显示为蓝色圆圈，用绿线连接)是ATP的氢键供体。糖环外环O原子O3′与磷酸O原子O2B之间可能存在较强的内氢键，具有Ohellip;O距离2.47Aring;(如红色虚线所示)。八个水分子直接与ATP形成氢键，其中大多数通过氢键与蛋白质相连。O原子是红色的，N原子是蓝色的，C原子是白色的，P原子是黑色的，Mg原子是青色的。(b) PG-O3B键向下的投影图，显示重叠构象。

3.3氢键

三磷酸的O原子与水分子产生许多强烈的氢键相互作用。应该指出的是，所有三个末端O原子连接到gamma;-磷酸的P原子PG都有很强的相互作用。如上所述，O1G与Mg原子配位，O2G与溶剂分子(2.51Aring;)形成强氢键，O3G受体的两个N-Hhellip;O氢键来自Leu

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