巨噬细胞在胚胎斑马鱼肿瘤异种移植模型中增强Vegfa驱动的血管生成外文翻译资料

 2022-08-08 15:34:34

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巨噬细胞在胚胎斑马鱼肿瘤异种移植模型中增强Vegfa驱动的血管生成

摘要：

肿瘤血管生成长期以来一直是抗癌治疗的重点，然而，抗血管生成癌的治疗策略在临床上的效果有限。据信与肿瘤相关的髓样细胞在癌症对抗血管生成疗法的抗性中发挥作用，但作用机制尚不清楚。一种斑马鱼胚胎异种移植模型已被用于研究肿瘤血管生成的机制和筛选抗血管生成化合物。在这项研究中，我们使用细胞消融技术去除巨噬细胞或嗜中性粒细胞并通过量化移植血管的水平评估了它们对斑马鱼异种移植血管生成的贡献。巨噬细胞的消融而非嗜中性粒细胞的消融导致肿瘤异种移植血管形成的大量减少，同时延时成像显示，肿瘤异种移植巨噬细胞与肿瘤血管的发展尖端直接相关。最后，我们发现尽管巨噬细胞在分泌VEGFA或过表达斑马鱼vegfaa的异种移植血管形成中是必需的，但对于低水平VEGFA的移植血管而言，它们不是必需的，这表明斑马鱼巨噬细胞可以增强Vegfa驱动的肿瘤血管生成。巨噬细胞对这种血管生成反应的重要性表明，该模型可用于进一步研究髓样细胞与肿瘤血管形成之间的相互作用。

介绍：

由于其对肿瘤生长和转移的重要性，血管生成一直是癌症研究的重点。肿瘤脉管系统通常表现为有渗透性和形状不规则的血管的无序的网络，并通过一系列机制产生，包括新生血管的诱导，内皮祖细胞介导的血管生成，以及现有血管的增殖性。许多血管生成抑制剂药物已靶向血管内皮生长因子信号传导，一种途径通过刺激内皮细胞的增殖和迁移，在发育和疾病相关的血管生成中起关键作用。但是，VEGF抑制剂在临床上取得的效果有限，在初期缓解后癌症通常会复发。

炎症也可以驱动肿瘤血管生成，肿瘤区域中白细胞的存在与肿瘤血管形成水平呈正相关，并且与患者预后不良相关，巨噬细胞和中性粒细胞还可以在多种其他情况下促进血管生成，例如在发育性血管生成过程中和缺血后新血管形成过程中。巨噬细胞已显示可在小鼠模型中驱动肿瘤血管形成，而且肿瘤相关巨噬细胞的耗竭导致对靶向VEGFR途径的药物的反应有所改善，说明巨噬细胞有助于摆脱VEGFR抑制。肿瘤相关的巨噬细胞似乎通过直接或间接的机制刺激血管生成，从而增加促血管生成因子的水平或通过转分化为能够形成管状结构的内皮样细胞。中性粒细胞还显示出促进肿瘤血管生成的作用，特别是通过产生MMP-9来促进。

斑马鱼胚胎肿瘤异种移植模型利用了斑马鱼胚胎的光学透明性和荧光血管报告线的可用性来研究肿瘤血管生成的过程。该模型涉及将肿瘤细胞植入两天大的斑马鱼胚胎的卵周隙并观察接下来两天的血管生成反应。已经证明，生长到异种移植物中的血管形成了哺乳动物肿瘤典型的血管形态变化的异常网络。异种移植物可以在体内成像，可观察驱动肿瘤血管形成的机制，如新生血管、血管增殖性和内皮细胞迁移而且可以用于筛选新型抗血管生成药物。尽管这种模式取得了成效，但异种移植肿瘤细胞和肿瘤相关免疫细胞关于刺激血管生成的确切作用尚无定论。由于斑马鱼巨噬细胞先前已被证明是炎症性淋巴管生成所必需并表达促血管生成的vegf配体，这促使我们研究巨噬细胞在斑马鱼胚胎肿瘤异种血管生成模型中的作用。在这项研究中，我们发现，VEGFR依赖性血管生成是在将肿瘤细胞或非肿瘤细胞植入斑马鱼胚胎后发生的，而嗜中性粒细胞和巨噬细胞被聚集到这些移植物中，仅巨噬细胞在肿瘤异种移植血管生成中起作用。实时成像分析表明，巨噬细胞与发展中的肿瘤异种移植血管相关，表明它们直接介导了血管生成。我们还表明，异种移植VEGFA / Vegfaa分泌细胞时，血管生成需要巨噬细胞，而在VEGFA分泌水平低的移植物中则不需要巨噬细胞，这表明巨噬细胞在增强Vegfa驱动的血管生成中具有作用。这些研究结果表明，胚胎斑马鱼异种移植物可以模拟巨噬细胞介导的血管生成，并可用于揭示先天免疫和肿瘤血管形成之间的界面。

结果。

移植后观察到血管生成和免疫反应

为了研究先天免疫细胞在肿瘤血管生成中的作用，我们在受精后两天将B16-F1小鼠黑素瘤细胞，MDA-MB-231人类乳腺癌细胞，HEK293T人类胚胎肾细胞或非生物性Fluosphere珠粒植入胚胎的卵周隙。在注射后2天，我们用活体成像的幼鱼定量了移植物的血管状况并确定表达GFP的血管所占据的移植物的体积百分比。使用这种方法，我们发现B16-F1移植物显示出最高水平的血管形成，其次是MDA-MB-231细胞。令人惊讶的是，HEK-293T和Fluosphere移植物也诱导了血管形成，尽管其水平低于癌细胞系。还评估了这三种细胞系分泌的VEGFA的量，发现它与它们的血管形成水平呈正相关，B16-F1细胞分泌最高水平的VEGFA，其次是MDA-MB-231细胞，最后是HEK-293T细胞。为了支持VEGFR信号通路是移植物血管生成所必需的，VEGFR抑制剂替沃扎尼抑制了所有三种移植物的血管生成。FGF信号也与斑马鱼移植血管形成有关，但是单独或与替沃扎尼联合使用FGF / VEGFR联合抑制剂SU5402（Sun等，1999）进行的治疗与单独替沃扎尼治疗相比并没有进一步抑制移植血管的形成，说明FGF信号不是该模型中血管生成的主要驱动力。

接下来，我们通过计算注射后6小时、24小时、48小时内移植物中表达mpeg的巨噬细胞或表达mpx的中性粒细胞，评估先天免疫细胞向移植物聚集的情况。所有移植物类型均聚集巨噬细胞和中性粒细胞，巨噬细胞数量在注射后6小时达到峰值。B16-F1移植物在此时间点显示出最大数量的巨噬细胞，MDA-MB-231和HEK-293T异种移植物显示出相似的巨噬细胞聚集水平，而Fluosphere移植物显示出最低水平。当我们将巨噬细胞招募与移植物体积进行正常化时，也观察到了这些结果，尽管HEK-293T异种移植物显示出的巨噬细胞聚集水平与B16-F1移植物更为相似。

巨噬细胞有助于肿瘤异种移植血管化

鉴于所有类型的移植物均可诱导免疫细胞聚集和血管形成，我们想知道白细胞是否在血管生成反应中起作用。我们进行了氯膦酸盐介导的巨噬细胞消融，以特异性诱导移植物幼鱼巨噬细胞死亡。通过测量注射含氯膦酸盐脂质体的幼鱼和注射含PBS脂质体的幼鱼中移植物相关巨噬细胞数量的差异来评估巨噬细胞减少的功效。氯膦酸盐介导的巨噬细胞消融使移植物相关的巨噬细胞减少了至少40％（6 hpi），60％（24 hpi）和70％（48 hpi）。不会改变中性粒细胞向移植物聚集的水平，并且在注射后48小时时，MDA-MB-231和B16-F1异种移植物中的肿瘤血管形成减少了50％，相比之下，HEK-293T和Fluosphere移植物在接受巨噬细胞消融时，在注射后48小时的血管形成没有差异（图3A-H，J），这表明巨噬细胞仅在异种移植肿瘤的血管形成中起作用。与对照鱼相比，在接受巨噬细胞消融的胚胎中，异种移植血管的主要区别是减少了在肿瘤区域内生长的血管数量以及降低这些血管穿透肿瘤块的深度。这在B16-F1异种移植物中最为明显，在这种情况下，对照肿瘤通常在整个异种移植物中都具有丰富的血管生长网络，而接受消融的胚胎仅显示出少量血管在异种移植物的局部形成。

为了确认巨噬细胞-血管相互作用的重要性，我们定量了与血管尖端的结合或移植巨噬细胞。我们在以生长血管尖端（血管生成区域）为中心的10mu;m圆圈中测量了巨噬细胞的存在，并将其与距血管尖端恒定距离的相同大小的对照区域进行了比较。我们发现巨噬细胞比无血管控制区域更常见于这些发育中的肿瘤血管的尖端或附近，并且与无血管区域相比，位于血管尖端的巨噬细胞也更多，说明巨噬细胞在异种移植血管生成中起直接作用。我们将“尖端细胞”巨噬细胞定义为与发展中的移植血管远端尖端关联至少40分钟的巨噬细胞，并从MDA-MB-231和B16-F1移植物的时间推移影片中鉴定出12个尖端细胞巨噬细胞。与移植血管相关的尖端细胞巨噬细胞平均持续69分钟，在此期间停止主动迁移并保持与血管尖端的接触，只有在巨噬细胞脱离血管后才能恢复它们的正常迁移行为。我们还追踪了与血管相关联前后的尖细胞巨噬细胞，发现只有3/11的尖细胞巨噬细胞与另一个血管尖相关联，提示移植物中存在大量潜在的“尖细胞巨噬细胞”。

巨噬细胞是由移植物表达的vegfaa诱导有效血管生成所必需的

由于我们的异种移植物中的癌细胞表达VEGFA，而且异种移植物的血管化对VEGFR信号通路的抑制很敏感，这导致我们假设异种移植物相关的巨噬细胞可以增强由异种移植物提供的VEGFA驱动的肿瘤血管生成。为了验证这一假设，我们开发了表达VEGFA（vegfaa）的斑马鱼直系同源物的HEK-293T和MDA-MB 231细胞系。通过RT-PCR证实用zf-vegfaa表达载体转染的细胞系表达vegfaa（图S5A），当异种移植到斑马鱼胚胎中时，HEK-293T-vegfaa和MDA-MB-231-vegfaa异种移植物均显示 血管化水平显着高于对照组（图5A-E），而表达vegfaa的异种移植物中巨噬细胞的聚集与对照组相似。已证明氯膦酸盐介导的巨噬细胞消融在两种表达vegfaa的细胞系的异种移植中均有效，从而导致与移植物相关的巨噬细胞在注射后6小时至少降低50％，在注射后24小时至少降低80％。重要的是，巨噬细胞消融导致HEK293T和MDA-MB-231 vegfaa表达异种移植物的血管生成水平降低了40%，这支持了我们的假设，即巨噬细胞是表达vegfaa的移植物有效血管生成所必需的。移植血管主要由总主静脉(CCV)萌发而成。我们发现，表达vegfaa的异种移植物似乎诱导了非常强的血管生成反应，血管遍布整个异种移植物。相比之下，在巨噬细胞消融的胚胎中，异种移植血管靠近CCV，要么没有向远端延伸到肿瘤，要么只生长到异种移植的浅表层。通过将移植物分成相等的三部分来量化移植物的血管形成程度：在CCV的近端，中部和远端中量化血管形成的水平。我们发现，尽管巨噬细胞消融胚胎中的移植物的近端血管化水平相似，但与对照组相比，移植物的中端和远端三分之一的血管化水平明显较低。

耗尽VEGFA的MDA-MB-231异种移植物的血管化不需要巨噬细胞

为了确定巨噬细胞在移植物血管形成中的作用是否局限于由异种移植物提供的VEGFA驱动的血管生成，我们使用siRNA敲除MDA-MB-231细胞中的VEGFA。与对照组siRNA处理的细胞相比，siRNA处理的细胞分泌VEGFA水平降低了85%，导致移植物血管化降低了50%，尽管移植物相关巨噬细胞的水平保持不变。当用氯膦酸盐消融巨噬细胞时，移植物血管形成水平保持不变，这表明在VEGFA水平较低的异种移植物中，血管生成并不需要巨噬细胞。

讨论

斑马鱼胚胎肿瘤异种移植模型已被开发来替代啮齿动物和鸡做异种移植肿瘤血管生成研究。该模型于2007年首次描述，此后已用于进一步了解肿瘤血管生成的机制；识别感兴趣的基因，确定参与肿瘤血管生成的细胞过程，并阐明肿瘤血管执行的功能。虽然这个模型已经得到广泛应用，但斑马鱼异种血管生成的确切机制仍不清楚。在这项研究中，我们发现在斑马鱼肿瘤异种移植物中观察到的血管生成反应具有炎症驱动成分，巨噬细胞是产生VEGFA/vegfaa的异种移植物有效血管生成所必需的。

我们使用了移植物的3D图像分析来量化肿瘤血管生成，这使我们能够确定不同移植物的血管生成潜力以及不同治疗策略对血管生成反应的影响。在对该模型的最初描述中，Nicoli等人发现某些非肿瘤哺乳动物细胞系不会诱导血管生成反应，但是我们观察到非肿瘤细胞系有轻微的血管生成反应，甚至在植入非生物Fluosphere移植物后也是如此。我们对移植物的血管形成进行的定量分析可以解释这种差异，尽管之前的研究使用不太敏感的定性分析来测量植入非肿瘤细胞系的血管生成效果。因此，我们建议在以后的研究中使用这种模型时，应像本研究中所描述的那样进行定量分析。

我们对巨噬细胞和中性粒细胞聚集的观察与其他使用该模型的研究一致。我们观察到肿瘤和非肿瘤异种移植物以及Fluosphere移植物中的巨噬细胞和中性粒细胞募集。这种聚集似乎遵循一种模式，即白细胞数量在前注射后6小时增加，随后巨噬细胞数量在接下来的注射后2天减少，证明移植物早期和高水平的白细胞聚集。我们使用氯膦酸脂质体和硝基还原酶介导的细胞消融来减少巨噬细胞数量，对异种移植血管的形成定量测量。我们发现巨噬细胞对于表达VEGFA或斑马鱼vegfaa的异种移植物的有效血管化是必需的，当从表达VEGFA的异种移植物(B16-F1或MDAMB-231)或过表达vegfaa的异种移植物中去除巨噬细胞时，血管化显著减少。我们的数据是基于使用spi1b吗啉代抑制骨髓谱系后血管化减少的定性观察结果，这支持了以前巨噬细胞参与斑马鱼移植血管化的证据。我们的研究结果也支持在小鼠模型上的研究，在小鼠模型中，巨噬细胞的增加或减少分别导致肿瘤血管化的增加或减少，而在人类肿瘤中，巨噬细胞的存在与肿瘤血管生成增加和患者预后不良相关。

HEK-293T异种移植物中巨噬细胞的高水平但血管生成不良，表明移植物相关巨噬细胞的存在不足以诱导高水平的血管生成。我们还证明，只有当移植物细胞表达VEGFA/vegfaa时，巨噬细胞才被需要于用于移植物血管形成；与表达VEGFA的B16-F1和MDA-MB-231肿瘤异种移植不同，在Fluosphere或HEK-293T移植物中，它们分别不表达VEGFA或表达低水平的VEGFA，巨噬细胞在移植物血管形成中没有明显的作用。此外，我们发现巨噬细胞不是低VEGFA水平MDA-MB-231异种移植物血管形成所必需的，而相反，巨噬细胞是过度表达vegfaa的HEK-293T移植物血管形成所必需的。综上所述，这些数据表明在不同类型的移植物之间，移植物巨噬细胞的血管生成潜能可能存在差异，并且这与从移植物中分泌的VEGFA的水平不同有

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