缬草的水溶液和乙醇溶液提取物改变谷氨酸 受体与配体的结合外文翻译资料

 2022-10-30 10:10

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缬草的水溶液和乙醇溶液提取物改变谷氨酸

受体与配体的结合

在不同受体配体存在下，通过使用大鼠突触膜测定[3 H]谷氨酸盐（[3 H] Glu）和[3 H]氟洋地黄（[3 H] FW）受体结合来研究两种缬草提取物的效能。同时，提取物稳定性通过分光光度法监测。两种提取物表现出与离子型谷氨酸受体（iGluRs）相互作用。然而，提取物在受体选择性方面显示出相当大的差异。水醇提取物选择性地与使君子氨酸,组I代谢型谷氨酸受体（mGluR）配体作用，尽管水提取物没有改变QA的结合。在几周内再检查提取物的稳定性。刚开始的提取物抑制38-60％的[3 H] FW结合（AMPA），10天后，水提取物抑制85％的[3 H] FW结合而水醇提取物显着增强（200％）[3 H] FW与AMPA受体的结合。因此，我们的结果表明如提取溶剂和提取物稳定性等因素决定了谷氨酸受体（GluR）相互作用的选择性。

  1. 简介

缬草属(Valeriana L.)属败酱科(Valerianaceae)，学名缬草，大约含有250种不同种类，其常被用于制备具有镇静，抗焦虑和解痉作用的植物药。缬草的治疗功效一直处于争议中，由于不一致的临床结果 [1–3]。临床试验中的差异可能是由于在缬草的制备中方法的限制和不同（提取的方式和溶剂）。很多研究采用水作为提取溶剂，因为传统的天然产品制剂（如茶）就是用水来提取的。水溶液提取物与醇提取物相比，其含有不同的活性成分光谱 [4]。

缬草提取物的具体的行动机制药理作用没有充分阐明,虽然被认为是缬草根提取物刺激GABA作用[2,3，5-10]。另一方面，很少有研究调查了这些影响的缬草在兴奋性谷氨酸盐介导神经传递[11]。

基于这些研究，通过与大鼠的受体结合测定来评估缬草提取物对谷氨酸介导的（兴奋性）神经递质可能存在的影响，如突触膜在水和水缬草提取物和谷氨酸受体配体（MK-801用于NMDA，AMPA或[3 H]氟桂腈用于AMPA，KA的红藻氨酸和I组的quisqualic acid（QA）代谢型谷氨酸受体（mGluR））。

  1. 材料和方法

化学品。L- [2,3,4-3H] - 谷氨酸（60Ci / mmol）和[3 H]氟维拉尔（80Ci / mmol）来自American Radiolabeled Chemicals，Inc（St.Louis，MO）。AMPA（alpha;-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑 - 丙酸）得自Tocris Cookson，Inc（Ellisville，MO）。氯化钾购自Matsheson Coleman＆Bell（Norwood，OH）。 UniverSol ES得自MP Biomedicals（Solon，OH）。 所有其他试剂从Sigma Chemical Company（St.Louis，MO）得来。

图1：不同新鲜缬草提取物（1mg / mL）对[3 H]谷氨酸盐与大鼠突触膜结合的影响1mM谷氨酸受体（GluR）配体。（a）含水提取物降低了NMDA（MK-801），AMPA和Kainate（KA）的作用，但它并未改变I组代谢型谷氨酸受体（mGluR）配体quisqualic acid（QA）的作用。（b）水醇提取物也降低了NMDA，AMPA和KA的作用。相比之下，缬草逆转QA的抑制作用。

激动剂与激动剂

缬草，P lt;.05;

P lt;.01; P lt;.001。

2.2缬草提取物来自有机种植和认证的淡水河谷里根干粉（Lot.1111H-OUP），2004年获得了Pacific Botanicals（LLC Grants通过，俄勒冈州）。 商业缬草自然资源提取物（Lot。LD11282N）和Natures Resource Herb（Lot。MG11258）是从当地药店购买的。缬草在超纯水或乙醇（EtOH）70％（1：10w / v）中萃取，约23℃，搅拌1小时，过滤通过12.5cm 定性号 1过滤器。以6,700g离心除去微粒并储存在4℃环境下。

2.3 脑皮层突触膜。 分析生物所（Wilmington，DE）准备的突触膜如下：几个月雌性大鼠约2只将其斩首然后将大脑迅速剃除。将皮层解剖并匀浆1:10w / v）在冰冷的pH 为7.4的10mM Tris-HCl缓冲液中混匀。 匀浆在2500g离心10分钟。得到的上清液在12,500g离心20分钟。将沉淀用冰冷的pH 7.4的10mM Tris-HCl缓冲液（1:10w / v）溶解，并以12,500g离心20分钟 将颗粒（突触膜，P2）重加入于pH7.4的10mM Tris-HCl缓冲液中并冷冻解冻至少三次，然后储存在 - 80°C直到使用。使用该蛋白质测定蛋白质浓度

Bradford测定[12]采用牛血清白蛋白（BSA）作为参考标准。

2.4 受体结合分析

2.4.1 [3 H]谷氨酸结合。受体结合竞争 - 使用脑突触膜进行测定。通过加入组织开始反应（100mu;g蛋白质）至含有1mM（MK-801的NMDA，AMPA，KA的红藻氨酸和quisqualic acid（QA）对于I组代谢型谷氨酸受体（mGluR）和20nM [3 H]谷氨酸（[3 H] Glu）500mu;L50mM Tris HCl / 100mM KCl缓冲液，pH 7.4）。在1mM存在下测定非特异性结合非放射性谷氨酸盐。结合缬草提取物在不同溶剂（H 2 O或乙醇）中的含量），来进行竞争研究。所有样品在冰（0-4℃）下孵育40分钟。在6,764g离心机上离心30分钟停止;提取上清液，用1mL冰冷缓冲液洗涤沉淀两次。将沉淀重新悬浮于其中500mu;L缓冲液。

2.4.2 [3 H]氟吡啶结合 测定分析来自大脑皮质突触膜，反应通过向管中加入组织（100mu;g蛋白质）引发。最终用体积为500mu;L的50mM Tris HCl / 100mM ，pH 7.4的KCl缓冲液测定含有15nM [3 H]氟吡啶（[3 H] FW））非特异性结合由10mM谷氨酸盐含量决定。

图2：随着时间3 [H]氟叶酸（[3 H] FW）与AMPA受体结合

率会发生改变。最初，用水提取物观察到60％的抑制而水醇提取物仅抑制38％。 但是， 之后水提物的抑制作用提高至85％而水醇提取物显着增强（200％）

为进行乙醇竞争性研究。所有样品均为在冰上（0-4℃）孵育40分钟。以6,764g离心机离心30分钟停止并测定。然后，除去上清液，将沉淀物洗涤两次与1mL冰冷缓冲液混合。将沉淀重新悬浮于500mu;L缓冲液。在带有1mL UniverSol的Beckman LS 1800计数器中量化放射性，结果显示为总数的百分比结合（plusmn;SEM）。

2.5波长扫描。 分光光度分析用Beckman DU Series 500分光光度计完成（Fullerton，CA）。体积为1mL的10mg / mL缬草

提取物置于Elkay Ultra-Vu一次性比色皿中，扫描是从190nm到320nm，步长为1.0nm。

2.6统计分析 数据显示为平均值与平均值（SEM）的标准误差相差较大的有三个实验。实验之间的差异使用单向分析测试组的显着性方差，随后是Tukey-Kramer多重比较测试，P lt;0.05。 实验组统计相对于总体来说，为了清楚起见未示出。

  1. 结果

3.1 提取溶剂改变谷氨酸受体与配体结合。图1显示了在1mM GluR配体的tic膜（NMDA，AMPA，KA或QA）存在下，不同缬草提取物对[3 H]谷氨酸结合大鼠突触的作用。 含水提取物（a）降低NMDA（MK-801），AMPA和红酸（KA）的作用。但它并没有改变quisqualic酸的作用（QA），水醇提取物（b）NMDA，AMPA和KA处理的水提物膜具有类似的效果。 然而，水醇提取物增强QA的影响，暗示mGluR对I组有很强的影响。

类似地，通过结合[3 H] FW测定来评估水和水醇的提取物对AMPA的影响。最初，含水和水醇提取物（图2）对[3 H] FW具有60％和38％的抑制作用。但是，随着时间的推移（4周），含水提取物将[3 H] FW抑制至85％，而水 - 天竺葵提取物显着增加[3 H] FW结合（200％）。

3.2 提取物稳定性改变配体与谷氨酸受体的结合。两种瓦莱里商业产品的效果（作为水提取物制备）通过AMPA测定进行评估。图3显示了时间对[3 H] FW结合的影响（a）在零时，天然缬草提取物和草药提取物抑制[3 H]FW结合。（b）经过一段时间（42天（提取物）或39天（草药提取物）降低抑制作用。进一步的时间（48天（提取））或45天（Herb），它们加强了[3 H]氟吡啶结合。

3.3水和水 - 醇提取物的光谱分析。不同缬草提取物（10mg / mL）在H 2 O和EtOH中制备的光谱，分光光度计显示如图4所示。图4显示了一个波长列表，292和298nm，显示出显著差异。

4讨论 缬草是一种公认的植物，民俗药物利用其镇静和抗焦虑性质[2]。许多研究评估了使用缬草提取物诱导和改善睡眠质量[13-15]和缬草的抗焦虑作用[16-18]。缬草提取物作为小剂量的苯二氮卓类[19]可以降低潜伏期以使人有效地入睡。虽然缬草的抗焦虑性质在小鼠和大鼠中有充分的证据[20]。但是没有科学证据可以支持缬草在人体中的抗焦虑作用的方法学问题。如缬草的变化剂量和制剂，患者数量和长度治疗[1]。

图3显示了时间对[3 H] FW结合的影响（a）在零时，天然缬草提取物和草药提取物抑制[3 H]FW结合。（b）经过一段时间（42天（提取物）或39天（草药提取物）降低抑制作用。进一步的时间（48天（提取））或45天（Herb），它们加强了[3 H]氟吡啶结合。

图4：水和缬草提取物（10mg / mL）的光谱和吸光度。 在292和298nm处具有显着差异被观察到。H 2 O与EtOH，P lt;.05; P lt;.01; P lt;.001。

不完全了解缬草的哪些成分产生药理作用，但许多厂商规范了缬草制剂根据德国委员会E.推荐的缬草烯酸含量。其研究表明缬草烯酸是缬草的抗焦虑性质主要的活性成分[21,22]。 然而，其他缬草成分如冰片，木脂素和类黄酮（橙皮苷，亚麻酸和6-甲基生物素）也被发现具有抗焦虑和镇静作用[23-27]。 此外，还有其他含有低戊酸的缬草类物质（如缬草和缬草素）也具有类似的药理学特征[19,28-30]。从而，没有证据显示，仅由缬草烯酸产生镇静和抗焦虑作用的药理学特征。

图5：测定受体结合和分光光度计测定的水和乙醇缬草提取物的吸光度效果的总结

Circosta和他的同事[31]对缬草进行了生物学和化学鉴定并发现显着的差异。发现类似的结果由Occhiuto等两人在2008年研究[32]。从同组研究人员透露，植物化学成分水提取物和水醇提物的分析中，在缬草烯酸组成（水溶液）中“相似”提取物为水醇提取物含量的一半），

但是缬草素的浓度要低得多，在水提取物中比在水醇提取物中。在生物测定，Circosta及其同事[31]观察动物心律失常的百分比较低给出了水醇，而不是水提取物剂量为50mg / kg（相当于80％对60％）。同样，Occhiuto等人[32]报道引起收缩幅度抑制（子宫 - 轻度效应）为的浓度为50%的29.5plusmn;3.40和68.7plusmn;5.20mu;g/ mL水醇和水提取物。因此，这些研究的生物学分析表明缬草提取物具有冠状动脉扩张，低血压，和支气管扩张性以及对不同人的肌层肌肉放松效应的作用;水醇提取物总是更有效。这些水醇和水溶液的提取物效力差异受分散溶剂，原料储存条件，收获条件和植物的年龄等其他因素影响。

同样，Malva和他的同事[11]报道了缬草对AMPA介导的神经保护作用。我们的实验表明，来自缬草的水提取物和水醇提取物有所不同通过GluR与NMDA，AMPA和KA受体结合来证明。另一方面，水溶液提取物在QA中没有作用，而a观察到mGluR水醇提取物（参见图5）与I组的强相互作用。以前的结果从我们的实验室（未显示）已经证明，当时使用缬草烯酸作为纯化合物，类似的反应（增强）也有很多。这些结果表明水醇缬草提取物抑制效应可能由于缬草烯酸含量较高。应该进行深度学习来进行验证，以验证其中的缬草烯酸含量不同产生不同的抑制作用。

以前的研究表明，不同的研究人员认为mGluR可能在抗焦虑中起着重要的作用[34-36]。特别是有证据显示，II组mGluR（mGlu2 / 3）和I组mGluR（mGlu5）受体激动剂是潜在的抗焦虑剂[37,38]。 这个mGluR的角色可能可以阐明缬草提取物产生作用的可能机制。为了对这些缬草提取物进行更详细的研究，我们的实验室正在进行实验去验证mGluR和缬草提取物的相互作用。

Navarrete等（2006）[29]

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