阿达帕林的药理学和化学研究外文翻译资料

 2022-01-11 10:01

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阿达帕林的药理学和化学研究

Braham Shroot博士和Serge Michel博士，Sophia Antipolis（法）

背景:局部应用维甲酸和口服异维甲酸来治疗痤疮的临床应用成功，以及维甲酸高亲和力结合蛋白的发现及其与其他维生素和激素的作用和相互作用，影响了皮肤病学领域的维甲酸类的研究。

目的:我们在局部痤疮治疗中力图寻找稳定性、有效性和局部耐受性之间达到最佳平衡的分子。

方法:采用体外和体内生物检测系统，检测维甲酸类药物的调节细胞增殖和分化能力。此外，抗炎症性质也会得到评估。用结合法和反活化法比较了阿达帕林和维甲酸对核转录因子维甲酸受体(RARs)的亲和性和转录活性。

结果与结论:阿达帕林是一种性质稳定的萘甲酸衍生物，具有较强的维甲酸药理作用，可以控制细胞的增殖和分化。此外，它还具有显著的抗炎症作用。并且核基因转录因子RARbeta;和RARgamma;能调节阿达帕林的类黄酮活性。

阿达帕林对细胞的增殖分化作用是由维甲酸受体(RAR)结合蛋白与基因反活化介导的。在给犀鼠局部给药后，可以在体内观察到一种强的消肿作用。与天然维甲酸相比，维甲酸和异维甲酸抗炎作用有增强，这可能部分解释了体内耐受性得到改善的原因。这些资料促进了选择阿达帕林来作为治疗局部痤疮的发展。

图1描述了几种类维生素a的化学结构。这是从易曲的、光不稳定的共轭双键系列(维甲酸[Ⅰ]、异维甲酸[Ⅱ]、阿维A酯[Ⅲ])到全芳香族萘衍生物(TTNN [IV]、阿达帕林[V])的发展过程。

在痤疮患者中，其角质细胞分化和增殖的正常程序都受到皮脂腺导管或表皮的干扰。这是伴随着慢性炎症成分，细菌定植，并且有免疫系统的参与。我们测试了这些分子修改所有三个因素的能力，从而选择效力和局部耐受性最好的分子。

天然产物和维甲酸[I]的化学结构的改变，最初是为了增加在化学和生物化学方面不稳定的母体物质的生物半衰期。虽然这产生了另一种药物，阿维A酯 [Ⅲ]，但由于其在体内停留时间长和缺乏局部疗效，导致它在治疗银屑病方面的应用受到损害。

与维甲酸相比，阿达帕林，CD271[Ⅴ]，从我们的实验中被选为最佳的局部活性强效药物，它具有高稳定性(图2和图3)和低局部副作用。

图1.一些天然的和合成的维甲酸类的化学结构

阿达帕林 维甲酸

官能团 性质 结果

萘甲酸 芳香族的 对氧/光稳定

苯氧基金刚烷 高熔点 低透皮通量

苯氧基金刚烷 低溶解度 皮肤中含量高

图2.阿达帕林和维甲酸的理化性质

图3.阿达帕林和维甲酸在日光下的稳定性。

材料与方法

体外试验

F9细胞分化

F9小鼠胚胎癌细胞是在杜尔贝克氏培养基中培养的，在培养基中添加了胎牛血清。用类维生素A药物处理细胞3天。使用0.02个酪蛋白单位/ml的纤溶酶原和1mmol/L的酪蛋白底物S2251来测定培养基中的纤溶酶原激活物的分泌。

转谷氨酰胺酶在正常人角质形成细胞中的表达

正常人角质形成细胞(NHKs)在低钙半限定培养基中能生长至亚融合状态。转谷氨酰胺酶是形成复合膜的主要酶之一，在高钙培养基中培养4天，可以诱导转谷氨酰胺酶(TgaseI)的表达。同时，在培养基中加入类维生素A。Tgase I的表达通过采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定NHK来衡量。

HeLa细胞增殖

将HeLa细胞以低密度接种于胎牛血清补充液培养基中。然后用类维生素A处理4天。然后用线粒体活性标记物(XTY法)测定类维生素A的抗恶性增殖能力。

重建皮肤

先制备了底摩尔等价物或胶原晶格，再将NHKs接种于胶原晶格上，将培养液浸泡1周，第二周在气液界面培养。然后将类维生素A添加到培养基中。用组织学方法对重建后的皮肤进行形态学观察。采用针对角蛋白K10和聚丝蛋白的单克隆抗体对冷冻切片进行间接免疫荧光染色的方法。

RAR受体结合

用编码人类的RARalpha;、RARbeta;和RARgamma;受体的基因编码转染cos-7细胞。然后制备核提取物，用于进行竞争性结合实验，并使用性质稳定的维甲酸类似物[sup3;H]-CD367进行对照实验。再用高效凝胶过滤色谱(HPSEC)分离结合配体和游离配体。

转录激活实验

将HeLa细胞与人的RARalpha;、RARbeta;、RARgamma;受体等表达载体之一进行共转染，并与TRE3-tk-CAT报告基因质粒共转染。然后在类维生素A的存在下培养24小时。再采用ELISA法测定CAT的表达。

体内试验

犀鼠模型

犀鼠是一种突变体。在7到8周的时候，它会脱落毛发，毛囊导管会变宽，并且积聚角蛋白和其他蛋白质从而形成类似于人类痤疮的微粉刺。运用标准化的垂直运动图像分析技术，可以评估出外用3周的类维生素A能够减少这些胞囊的大小。

表皮鸟氨酸脱羧酶（ODC）试验

表皮ODC活性是由无毛大鼠皮肤的纤维素胶带的剥离诱导出的:胶带剥离后立即局部应用维甲酸类药物，6小时后测定出可以显著抑制ODC的诱导。

小鼠外用花生四烯酸后出现耳肿胀

在花生四烯酸溶液中加入维甲酸类化合物，并在使用2小时后会测量出水肿现象。

结论

阿达帕林调节细胞分化

采用过的体外筛选模型之前已经描述过(表I)。类维生素A的一个特性是它们具有调节细胞分化的能力。这种能力取决于细胞类型，也取决于生理、病理和体外培养条件，这种调节可以导致抑制现象或抑制分化。

表I.阿达帕林和参照化合物对HeLa细胞增殖及对F9细胞与正常人角质形成细胞分化的影响

类维生素A

HeLa细胞的IC50(nM)

F9细胞的Ac50（nM）

NHK TGase I表达IC50 (nM)

阿达帕林

维甲酸

异维甲酸

16 40 2.5

6 200 24

10 190 2.6

阿达帕林诱导小鼠胚胎癌细胞的分化

用全反式维甲酸(ATRA)对小鼠胚胎癌细胞系F9进行处理，会导致上皮细胞的诱导，同时伴随着特异性标志物、纤溶酶原激活剂和层粘连蛋白的分泌，这表明F9干细胞转化为了内胚层样细胞。组织型纤溶酶原激活物在培养基中的分泌在该系统中易于定量测量。图4为用全反式维甲酸ATRA和阿达帕林处理后纤溶酶原激活物诱导F9细胞的剂量响应曲线。在这项试验中，阿达帕林的活性至少是维甲酸的三倍。

纤溶酶原激活物（% max）

类维生素A浓度（nM）

图4. 阿达帕林或维甲酸治疗后小鼠畸胎瘤F9细胞分泌纤溶酶原激活物

阿达帕林体外抑制角质形成细胞转谷氨酰胺酶的表达

在培养的角质形成细胞中，维甲酸能够抑制质膜相关酶转谷氨酰胺酶I型的表达。这种酶在角质形成细胞分化的最后阶段会催化质膜下面形成一个结合的包膜。维甲酸或阿达帕林浓度的增加对TGase I表达的影响可以用酶联免疫吸附测定法来定量。如图5所示，阿达帕林的细胞半数最大抑制浓度（IC50值）为2.5 nmol/l。在本次试验中，阿达帕林的效力是维甲酸的10倍。

TGase I 的表达（% max）

图5. 酶联免疫吸附试验显示阿达帕林和维甲酸降低TGase I的表达

阿达帕林具有抗增殖作用

HeLa细胞源于宫颈癌，具有高度增殖的能力。它们可以用于测定类维生素A的抗增殖活性。通过XTT法测定线粒体活性，可以方便地量化这种效应。在本次实验系统中，维甲酸、异维甲酸和阿达帕林对于抑制细胞增殖具有相当的效果。

如表I所示，阿达帕林的药效与其他类维生素A相当或者是优于其他。这些数据可以用两种现象来解释。首先，阿达帕林比全反式维甲酸ATRA性质更稳定。其次，阿达帕林具有不同于细胞的和胞核的维甲酸结合蛋白的结合特点。

阿达帕林对皮肤重建的影响

在重建的皮肤模型中，阿达帕林能够改变表皮形态的形成以及角质形成细胞的分化。重组表皮的形态学特征和角质形成细胞特异性分化标记物、角蛋白K10和聚丝合蛋白的表达均受阿达帕林和维甲酸的剂量依赖性调节。在一项初步研究中，通过使用市面上可获得的再造皮肤系统，发现了阿达帕林对再造皮肤的存活有着有利的影响(图6)。而使用相同浓度的维甲酸，其效果却较差。

图6. 阿达帕林和维甲酸对表皮重建的影响。这些物质被导入细胞培养基中。对照组培养第3天，A和第11天,B的组织学观察。暴露于C，阿达帕林 (100 nmol/L)和D，维甲酸 (100 nmol/L) 11天后的效果。

动物药理学

人类寻常痤疮的特征是细胞的增殖和分化发生了改变。因此，阿达帕林改变这些细胞功能的能力是其在治疗这种疾病中发挥作用的先决条件。

阿达帕林具有消肿作用

犀牛鼠的表皮中含有大量的包有角质层碎屑的小囊，形成了皱褶的表皮。局部应用阿达帕林可减少这些小囊的数量。这种活性与维甲酸相似或者优于维甲酸。相比之下，阿达帕林的粉刺间表皮增生反应要低于维甲酸(图7)。

每厘米SC长度表皮粉刺数量

表皮厚度（mu;m）

粉刺大小 r=d/D

丙酮中的阿达帕林

丙酮中的阿达帕林

丙酮中的阿达帕林

** 0.001lt; p lt; 0.01

*** p lt; 0.001

---- Retinoic acid 0,1% in acetone

图7. 阿达帕林和维甲酸在小犀牛鼠粉刺模型中的活性。局部应用阿达帕林可减少表皮粉刺的数量，增加表皮厚度。粉刺的特征表示粉刺闭合情况。0.1%维甲酸的活性用水平折线表示。

阿达帕林具有抗增殖活性

鸟氨酸脱羧酶（ODC）活性的诱导是DNA开始合成的先决条件，对于细胞增殖的增加也是必不可少的。外用阿达帕林可显著抑制胶带条诱导的无毛大鼠表皮的ODC活性。观察到的抑制作用与异维甲酸和阿维A酯相比是相当的或者更好，但低于维甲酸。

阿达帕林具有抗炎症活性

在探讨阿达帕林的药理作用时，进一步探讨了其抗炎方面的活性。多形核中性白细胞的迁移和花生四烯酸代谢是与多种皮肤炎症反应相关的两个因素。阿达帕林能够显著抑制人类外周血的多形核趋化以及中性粒细胞趋化肽f-met-leu-phe的趋化反应。阿达帕林对产生花生四烯酸类化合物(包括A、B、C、D、E、F族的白三烯、HETE和脂氧素类)的单、二、三羟基代谢物的5-脂氧合酶和15-脂氧合酶途径有着显著的抑制作用(图8)。利用大鼠精囊匀浆来体外测定的阿达帕林抗环氧合酶活性，比5-脂氧合酶和15-脂氧合酶途径的活性至少少100倍。

对小鼠耳部单次局部应用花生四烯酸能够诱发炎症，这可归因于产生了脂氧合酶和环氧合酶产物。局部应用消炎镇痛等非甾体类抗炎药如吲哚美辛可以抑制水肿，皮质类固醇药物如倍他米松戊酸酯对水肿的抑制作用较弱。在这个急性炎症模型中，局部应用阿达帕林具有与吲哚美辛和倍他米松戊酸酯相当的活性。在相似的实验条件下，维甲酸是没有活性的。

图8.左图：阿达帕林和参照类维生素A对人类多形核白细胞（PMN）的5-和15-脂氧合酶的体外抑制作用及对家兔PMN氧化突变的抑制作用。右图：阿达帕林和参照类维生素A对花生四烯酸诱导的豚鼠耳水肿和紫外线诱导的红斑的体内抑制作用。

阿达帕林和维甲酸的信号通路

类维生素A化合物通过与一类转录增强因子/抑制因子结合而对基因表达产生显著影响，这些因子属于配体激活的核激素受体超家族。维甲酸受体亚型RARalpha;、beta;和gamma;和维甲酸X受体亚型RXRalpha;,beta;,gamma;作为异质二聚体结合到类维生素A敏感基因的启动子区域(回顾,参见参考资料1)。此外,RXR可以同型二聚体化或与受体超家族的其他成员如维生素D受体等形成同型二聚体。

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资料编号：[1646]

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