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细胞群扩大时的条纹图案的顺序建立
Chenli Liu,1* Xiongfei Fu,2* Lizhong Liu,1 Xiaojing Ren,3 Carlos K.L. Chau,1 Sihong Li,2 Lu Xiang,1 Hualing Zeng,2 Guanhua Chen,3 Lei-Han Tang,4 Peter Lenz,5 Xiaodong Cui,2 Wei Huang,1,2dagger; Terence Hwa,6dagger; Jian-Dong Huang1dagger;
摘要 周期性条纹模式在生物体中是普遍存在的，但其潜在的发育过程是复杂的，很难理清。我们描述了一个合成遗传回路将细胞密度和活动性结合起来。该系统使基因调控的大肠杆菌细胞能够按顺序和自主形成周期性的高、低细胞密度的条带。理论分析和实验分析表明，在细胞数量不断增加的过程中的周期性的聚集效应促使了细菌群落空间结构的形成。形成条纹的数量可以通过调控单个基因的基础表达来调节。本文的结果建立了马达控制作为建立周期结构的简单方法，不需要外部时钟。
生物体显示出惊人的一系列规则的空间模式(1-4)。传统上，通过正向或反向遗传学来阐明它们的发育机制(3,5)。然而，模式形成和控制所需的基本成分往往隐藏在极其复杂的生理环境中。合成生物学为研究提供了一种工程方法来检测模式形成策略(6-8)。最近，人们正在努力模拟带有预先沉积的位置线索的模式系统(9,10)。这些研究没有涉及形态形成的关键的空间或时间自组织。事实上，在胚胎发育过程中，协调细胞运动对自我产生的信号做出反应是很重要的(11-13)。在这里，我们研究当细胞移动性受细胞密度控制时在细菌菌落生长中出现的惊人模式，被解释为最简单的模式形成线索的例子之一(14)。
图1 大肠杆菌工程菌株形成的时空图样。(A)感兴趣的细胞行为的示意图。(B)遗传回路的设计；见正文。(C)用qRT-PCR法测定CL3菌株体培养时细胞密度与相对cheZ和cI mRNA水平的函数关系。数据以0.3times;108 ml- 1的平均值归一化。(D)相对扩散系数作为细胞密度的函数。CL3GFP，即CL3菌株携带超折叠GFP。以CL4(cn)菌株为对照(携带密度传感分子，但由本地cheZ调控)(18)。相对扩散系数值用CL3GFP在0.4times;108 ml-1处的平均值进行归一化。结果是三个独立实验的代表性数据。错误条表示三个复制的SD。工程菌株CL3 (E)和对照菌株CL4 (F)的典型模式的延时照片;参见视频S1和S2。(G) (E)的时空图。所有实验均在37℃下进行。标尺，1厘米。
我们构建了一个基因回路来抑制大肠杆菌细胞在高细胞密度下的运动(图1A)。该回路由两个模块组成:密度传感模块和运动控制模块(图1B)。采用菲氏弧菌群体感应系统作为密度传感模块，对局部细胞密度进行信号处理。该系统合成并分泌小分子酰基同丝氨酸内酯(AHL)， AHL在细胞外高浓度(反映高细胞密度)下，在细胞内聚集并激活构成表达的调控因子LuxR(15)。通过调控cheZ的转录，设计了移动-控制模块来修饰细菌的运动性。cheZ缺失导致细胞不断翻滚，导致半固态琼脂中出现非运动表型(16)。重新引入cheZ可以恢复细胞活力(17)。在我们的回路中，两个模块的耦合是通过lambda抑制因子(CI)实现的:LuxR-AHL复合物驱动CI的表达，进而抑制cheZ转录(图1B)。在此设计的基础上，我们创造了一个工程菌株，CL3(18)。
采用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)对菌株CL3在不同细胞密度下的基因表达进行了定量表征。按照设计，随着细胞密度的增加，CI表达水平(红色)增加了40倍以上，而cheZ表达水平(蓝色)急剧下降至峰值水平的5%(图1C)。采用改进的连续荧光光漂白法(CPB)测定了半固态琼脂的细胞活力(18)。当细胞密度为4times;108 ml-1时，细胞密度突然下降(图1D，紫色符号)。
当以指数增长的CL3细胞悬液接种于一个8.5厘米的皮氏培养皿，含有10毫升LB培养基和0.25%琼脂，一夜之间出现了白色(高细胞密度)和黑色(低细胞密度)相间的条纹(图1E和视频S1)(18)。条纹按顺序形成，间隔约0.5 cm，每隔约2小时形成一次。这些条纹稳定了好几天，直到琼脂完全干燥。作为控制，菌株CL4(携带密度传感模块，但由CheZ调控)表现得像野生型(16)：从培养液的位置，两个移动波先后径向向外移动，紧随其后的是一个统一的扩张没有条纹的细胞密度(图 1 F和视频S2)。我们进一步验证了所设计的遗传回路中的每个元素都是条纹模式形成所必需的（图S1）。我们同样研究了营养成分、琼脂厚度、湿度、初始细胞浓度、体积和生长周期的影响，发现图案对于各种条件都有很好的鲁棒性（图S2）。尤其是当图案模式甚至对于CheB-CheR-趋化性双重失效的情况[图S2J（19）]但是可以随机游动和滚动下依然存在，表明swarm并不是趋化性的结果。并且，在其他条件相同的情况下，如果在低水平CL3细胞预混的琼脂上存在CL3细胞，则不会产生条纹图案，这表明该模式不是图灵不稳定性参数的自发放大所导致的。
我们通过培养皿的吸光度来监测时空细胞的密度分布[图S3和(18)]。图1G显示了光强沿穿过接种体的对角线的时间过程，颜色条指示了光强，正如图1E所示的那样。它表明，低和高细胞密度的条纹一旦形成，便被冻结在空间。此外，高细胞密度的新条纹在一定的时间和距离间隔出现。在矩形图形中也观察到了同样的现象，当细菌沿着平板中间的一条细线生长时（18）。条纹向相反边缘发展和传播（图S4A和视频S3）适用于CL3菌种但不适用于野生菌种或CL4细菌。傅里叶分析显示出高度的空间周期性，波长为0.5 cm（图S4B）。
为了定量地理解图形化过程，我们根据设计的回路的特征建立了数学模型(图2)(18)。在种群水平上，用细胞密度rho;(x,t)的扩散式方程(公式 S1)描述了细菌细胞的随机游动和翻滚运动。AHL的合成、扩散和周转率由公式S2描述，养分n(x, t)的消耗和扩散由公式S3描述。AHL依赖的移动性通过现象学扩散系数mu; (h)表示，当局部AHL浓度h(x, t)超过阈值Kh时，mu; (h)急剧下降(图2A)。Eqs S1到具有实际参数值的S3(23)的数值模拟(表S3)(18)给出的模式和在一维和二维几何中生成与实验观测结果相似(图S5和S20)。该模型还捕获了通过多次植入形成的更精细的模式(图S6)。
图2 自主周期条纹图案形成的动力学模型。(A)模型包括三个关键成分:细胞密度(r)、AHL浓度(h)和营养水平(n)；见正文和(18)。该模型的关键特征是，根据图1D中的数据，AHL依赖的细胞移动性mu;(h)由一个陡峭的Hill函数(红线)模拟，在hasymp;Kh(垂直虚线)处Drho;和Drho;,0之间存在突变。(B)模拟相对细胞密度曲线rho;(x, t)(蓝色)，AHL浓度h(x, t)(红色) 和营养水平n(x, t)(绿色阴影) 的时序图，;参见视频S4。运动调节Kh的AHL阈值为水平虚线；纵轴调整为细胞密度(108 ml-1)(18)。这种周期模式被认为是一个芽(B)形成的循环过程；这个芽随后生长成一个固定的丘(M)，在芽和扩展锋(F)之间的区域形成一个裂缝(C)结构。
数学模型揭示了在传播前沿发生的一系列有趣的事件(图2B及视频S4)。在早期(T = 150 min)，细胞密度(蓝线)与Fisher波前(2)一样，由于初始细胞密度低，AHL浓度(红线)均匀地低于阈值Kh(灰虚线)，细胞密度(蓝线)呈横向增长和传播。一段时间后(T = 300 min)，由于局部细胞增殖，AHL水平在锋后区域超过阈值：一个“芽”(用B标记)在密度图像中出现。同时，不会因为低细胞密度影响的前沿(用F标记)持续一恒定速度向前推进。再后来(T = 450min)，密度图像中的芽长成了“丘”(用M标记)，在前部一个“裂缝”(用C标记)处分开。在前沿后方区域细胞的持续增殖增长了AHL水平，然后产生一个新的芽(B #39; 在 T = 600 min时)，而丘和裂缝的横向运动最终停止(M和C 在T = 600 min时)。新的芽开始形成一个新的低移动性细胞条纹，它再次扩展成一个丘(M #39; 在 T =750 mi时)由裂缝分隔(C #39; 在 T = 750 min时)，这个过程周而复始。在离前沿较远的地方，随着营养物质的耗尽，丘和裂隙的细胞增殖最终都会停止(绿色阴影高度)。
把前沿从后方细胞的浓密区域和前沿后面的芽分离的裂缝的发展，是近年来理论研究中讨论的由密度相关动力驱动的聚集现象的结果(21,24)，如图三A所示。当细胞密度比较低时细胞可以在半固体培养基上自由生长(上图)。当细胞分裂增殖使局部AHL超过阈值，细胞的移动性下降如设计的那样(中图，有不移动的蓝绿色细胞)。这些细胞不移动，但是邻近细胞持续移动到这个高密度区域并且变得不能移动(下图)，导致有一个向高密度区域流动的净细胞流。
图3 密度依赖的细胞聚集运动 (A)密度依赖的聚集运动示意图；见正文。(B)有效聚集的实验验证。接受细胞用统一0.25%的琼脂混合。5微升的发送细胞(CL6，提供AHL但是没有移动性，绿色荧光蛋白表达)置于接受细胞-琼脂混合物中心，在37℃下培养12小时。具体细节见(18)。(上图)CL8菌种(带有完整基因回路但是缺少产生AHL的基因)荧光照片表示了发送细胞的位置。
野生型E.Coli细胞可能会在特定低营养介质中聚集，因为一种有效化学引诱物的分泌。为了展示聚集在我们的合成回路种也可以控制，我们设计了两种菌种：合成AHL但是不移动的发送菌种(CL6)，和可以接受AHL并调节移动性但不能合成AHL的接受菌种(CL8)。这些接受细胞与半固体琼脂混合均匀。随后，在固化细胞琼脂混合物的中心放置一滴发送细胞。发送细胞无法离开它们被接种的地方，但当它们在培养皿中央增殖时，它们可以合成并分泌AHL。经过12小时的培养，一条高密度的接收细胞条纹聚集在发送细胞接种处周围(图3B，上图，和视频S5)。在遇到高AHL浓度下不降低运动性的接受细胞(CL10)(图3B，下图)或其他对照组(图S7)中，没有观察聚集。因此，一种有效的聚集现象是由密度相关的运动介导的。
图4 可调谐的半纹图案。(A)相图；见(18，26)。(B)为协调斑纹数量所设计的基因回路。加入aTc诱导模块使CheZ的表达量不同。(C)在培养液中不同浓度aTc(0.1-3 ng ml-1)的CheZ mRNA和cl mRNA水平的关系。细胞培养至600 nm处的吸光度~0.05，采收待测。数据用CL3在0.3times;108 ml-1处的平均值进行归一化。(D)CL3的实验图案模式(亦如图S2G所示)或者接种于包含不同aTc浓度的0.25%琼脂的CL5。琼脂培养盘在37℃培养40小时。
对数学模型的详细分析表明，仅靠聚集效应不足以产生条纹。前沿的芽要求AHL水平达到局部最大值,从而发生只有当AHL分子足够短的扩散长度(AHL分布图紧随细胞密度分布图)，并且在细胞密度分布图中在前沿后的裂缝足够深。后者是由参数决定的，如最大细胞移动性(18,26)。模型的一个关键输出如相图(图4A)总结的，预测除了周期性条纹相外，工程菌种可能会展现一个没有斑纹的定性不同的行为，通过一个过渡区展示有限数量的条纹。
对相图(图4A)预测的相变发生的直接测试是改变细胞的最大运动(图2A中的Drho;)，从而改变条纹的数量。在我们的实验设计中，移动性是由cheZ是表达设置的，Drho;的调谐可以通过添加第二个cI基因来实现，该基因的表达是可滴定的AHL无关的方式(图4B)。这在应变CL5(18)中实现。图4C显示，在固定的细胞密度(红色符号)下，通过调节诱导剂无水四环素(aTc)的剂量，CL5细胞的基础cI表达水平确实可以平稳调节。在低细胞密度下也观察到相应的cheZ表达抑制(蓝色符号)。在固定的aTc水平下，cheZ表达的密度依赖性仍然存在(图S8)。当菌株CL5在半固态琼脂中心被发现时，与模型预测一致，条带数量随着aTc浓度从0.1增加到3.0 ng mlminus;1而逐渐减少(图4D)。作为对照，当aTc浓度增加到100ng mlminus;1时，菌株CL3的形态没有发生变化(图S2G)。
空间与/或时间模式协调良好的自然现象在发育系统中大量存在，据信涉及复杂的控制机制(3,5)。同样，在各种细菌系统(27-29)中条纹的形成被归因于复杂的影响，包括趋化性、群集性和差异性(4)。利用合成回路，我们证明了一个非常简单的交互作用——通过密度控制运动——可以自动生成精确而鲁棒性强的时空模式。循
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资料编号：[1568]
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