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气相色谱-质谱联用-泡腾辅助溶解碳浮选法提取水中四种三唑类杀菌剂
摘要：本实验建立了片状泡腾溶解对环境水体中四种三唑类杀菌剂进行预处理的方法。在这种方法中，使用由无毒碳酸钠和磷酸二氢钠组成的泡腾片在水相中产生的二氧化碳的特性，使得萃取剂更好的分散并加速目标分析物的传质。此外，简单的相分离仅仅基于水相中低密度有机溶剂的上升而不需要应用设备，这为在实际采样现场操作提供了可能。本研究的优化参数，包括泡腾片的组成，泡腾片的数量，萃取溶剂的种类和体积。在优化条件下，腈菌唑，戊唑醇，氧唑菌和苯醚甲环唑在1-100 g / L范围内线性关系良好。检出限和定量限分别在0.15-0.26和0.49-0.86 g / L的范围内。相关系数为0.997〜0.999，适宜富集因子为422-589。回收率为82.5-112.9％，相对标准偏差为4.7-13.5％。
关键词：气相色谱质谱法/现场提取/片剂泡腾/三唑类杀菌剂/水
一.介绍
在过去40年中，三唑类杀菌剂以其安全，高效和广谱的生物活性等特殊性质而闻名于世。然而，它们有些特点，如高化学和光化学稳定性，低生物降解性和易于在环境中迁移[1]，这引起了人类对水生生态系统和农产品潜在有害影响的严重担忧。此外，三唑类杀菌剂被证明是内分泌干扰物，对环境和人类健康有害[2,3]。因此，我迫切需要建立监测和分析环境样品中的这些杀真菌剂的方法。
通讯地址：浙江省杭州市下城区潮王路16号浙江工业大学化工学院李祖光教授。
缩写：AALLME，空气辅助液 - 液微萃取; DI-SPME，直接浸渍固相微萃取; EF，富集因子; LR，线性范围; r，相关系数; SBSE-DLLME，搅拌棒吸附萃取，分散液液微萃取。正如在早期的工作中，LLE和SPE是预处理和提取环境样品中三唑的常规方法。 LLE的主要缺点包括大量使用有毒有机溶剂，费时，操作繁琐和低浓缩因子（EF）[4]。 SPE具有比LLE更高的EF，但需要进行色谱柱调整[5]，并限制在分析复杂基质，成本高，同样耗时较长[6]。因此，它仍有较大的前进空间。在此基础上，许多推导出的方法已经发展到有机溶剂的简化，小型化和最小化的程度[6]。固相微萃取和分散液液微萃取（DLLME）是目前三唑预处理的主要方法。基于这两种技术的分离富集方法及其衍生技术已被用于从环境基质中分析三唑类。直接浸没式固相微萃取（DI-SPME）用于测定水果中的三唑类杀真菌剂[7]。基于各种纤维涂层结构的其他固相微萃取方法可用于测定水果，蔬菜或水中的三唑类杀真菌剂[8-12]。至于DLLME，它用于从牛奶中萃取和预浓缩三唑类杀虫剂[13];将搅拌棒吸附萃取与分散液液微萃取（SBSE-DLLME）结合使用，预浓缩来自aqueou的三唑类农药样品[14]，以及空气辅助液-液微萃取（AALLME）[6,15,16]，在窄口径管中的分散液 - 液微萃取[17]等[18,19] 。尽管提取三唑的技术已经成熟，但很少有研究强调现场提取。
2011年，首次将片剂泡腾用于协助Lasarte-Aragone [20]在分散微型SPE中分散吸附剂（OASIS-HLB）。生产二氧化碳是一个简单的反应，它可以帮助提取溶剂或吸附剂分散而无需额外的能量。类似的泡腾片剂作为近年来报道的分散作用已被应用于各种基质中的农药检测，包括果汁，水和人尿液样品[21-26]。它有很大的潜力适用于现场分析。
在这种情况下，本研究的目的是根据片剂的功效开发一种适合现场提取的方法。泡腾片剂辅助溶解二氧化碳浮选（TEA-DCF）以甲苯（比水轻）作为解决方案。在通过产生二氧化碳实现分散和传质之后，甲苯可以自动漂浮在水上以促成相分离。此外，整个过程不需要设备，因此它可以克服现场分析的问题。最终产品仅是不干扰目标分析物萃取的离子强度的增加，以及pH值（pH = 0.25）的变化可忽略不计，这使其适用于某些复杂样品。该方法可用于分析水中的三唑，GC-MS用于识别目标分析物。
二.材料和方法
2.1 试剂和样品
从惠灵顿实验室（加拿大）购买腈菌唑（96.5％），戊唑醇（97％），苯醚甲环唑（97.2％）和氧唑菌（96％）的标准。所有标准溶液均在甲醇中制备并储存在4℃下。所测试的萃取溶剂由以下来源供应：甲苯（C7H8）得自杭州化学试剂公司（杭州，中国）;正己烷（C6H14），环己烷（C6H14）和乙酸乙酯（C4H8O2）均购自国药集团化学试剂公司（中国上海）。 1-辛醇（C8H18O）得自Fisher Scientific（中国香港）。泡腾剂由以下来源提供：碳酸钠（Na2CO3）和碳酸氢钠（NaHCO3）购自Sihewei Chemical（Shanghai，China），磷酸二氢钠（NaH2PO4）和柠檬酸（C6H8O7）分别为购自国药集团化学试剂公司（中国上海）。无水硫酸钠（Na2SO4）购自Sihewei Chemical（中国上海）。
蒸馏水从Purite RO200-Stillplus HP系统（Purite Oxon，UK）获得。使用来自天津科技高新技术公司（中国天津）的压片机进行片剂制造。 pH值来自上海英纳斯科学仪器公司（中国上海）的PHS-3C酸度计。在具有歧管和适配器的自制玻璃圆瓶中进行提取。
2.2仪器和色谱条件
GC-MS分析在GC 2000-Mars 6100（Juguang Technology，Hangzhou，China）上进行。色谱分离是在DB-5 MS毛细管色谱柱（30 mtimes;0.25 mmtimes;0.25 m）上实现的。柱温箱最初保持在180℃/分钟，然后以5℃/分钟的速率将温度升至190℃并保持1分钟，之后以2℃/分钟的速率升至220℃。最后，温度以10℃/分钟的速度升高至290℃并保持6分钟。使用高纯度氦气（99.999％）作为载气，流速为1 mL/min。喷射器的温度以不分流模式保持在280℃。质量检测器条件为：传输线温度250℃;离子源温度180℃;电离模式-电子在70eV时的冲击。在4个范围内获得SIM（选择离子监测）扫描光谱：具有179和152的特定离子的腈菌唑的第一范围是12.0-15.5分钟;第二个为15.5-18.0分钟的戊唑醇，其特定离子为125和250;第三个是18.0-19.0分钟的氧唑菌，其特异性离子为192和138;苯醚甲环唑与265和323的离子片段的最后一次是19.0-24.0分钟。
2.3泡腾片制剂
最初，将适量的无水磷酸二氢钠和无水碳酸钠在100℃下在烘箱中干燥2h。然后精确称量865mg粉末（600mg NaH2PO4和265mg Na2CO3）并在研钵中手动研磨直至获得均匀且细的粉末。最后，用压片机在2MPa的压力下压缩混合物。准备好的片剂储备在惰性气体中以备后用。
2.4片剂泡腾辅助溶解二氧化碳浮选萃取工艺
提取过程如图1所示。 首先，将70微升甲苯注射到片剂的表面上。 之后，将这些片剂放入自制的实验仪器中，充当萃取池。然后，将50mL样品溶液倒入电池中。在这个过程中，片剂开始溶解，立即从溶液底部到表面发生泡腾。产生的CO2可以有效地将甲苯分散到含水样品中，增强了萃取剂和样品之间的接触面积。之后，将目标分析物萃取到萃取溶剂液滴中。不断漂浮的萃取溶剂可以从样品溶液中分离出来并很好地聚集在样品溶液的表面，萃取过程大约需要15分钟。随后，通过用注射器注入蒸馏水将漂浮的提取溶剂提升到自制仪器的窄管中。 最后，使用10微升微量注射器将上部有机相小心取出到含有少量无水硫酸钠的0.5mL锥底塑料PCR管中以除去微量水分，然后将1微升处理后的溶液注入GC-MS中以用于更深入的分析。
图1.通过TEA-DCF程序从水中提取三唑的示意图。
三.结果与讨论
3.1片剂 - 泡腾辅助溶解二氧化碳浮选概念的理论可行性
片剂泡腾从烧瓶的底部发生，二氧化碳气泡非常小且均匀，使得溶液中萃取溶剂能极大分散[26]。 但与其他泡腾方法不同，整个过程造成的pH值（pH = 0.25）的变化可以忽略不计，可用于现场提取。 低密度萃取溶剂的分散液滴附着在产生的气泡上，使其漂浮并聚集在样品表面上，并有效地将溶剂中的分析物转移到萃取剂中。
3.2组合物泡腾片
泡腾片的组成是一个关键的实验参数，它可以用来释放二氧化碳，以协助萃取溶剂在水样中的分散。 泡腾片具有两种成分，称为二氧化碳源和质子供体。
3.2.1二氧化碳源和质子供体的类型
为了形成泡腾片，选择碳酸氢钠和碳酸钠作为碱源。将磷酸二氢钠和柠檬酸作为酸源进行研究。考虑到所有可能的组合，四种片剂一式三份制备，根据相应的化学反应的化学计量比保持适当的比例。在此程序中选择泡腾片剂的量以产生相同的二氧化碳。图2显示磷酸二氢钠和碳酸钠具有最佳回收率和精确度。
选择性组分的吸湿性可以影响泡腾活性。片剂应该不含水分以保持泡腾能力。因此，最初的热处理是必不可少的[20]。与磷酸二氢钠相比，柠檬酸更易吸潮。伴随水分的柠檬酸也粘附在模具上，导致压片困难。而且，众所周知，碳酸盐比碳酸氢盐更热稳定。鉴于此，选择磷酸二氢钠和碳酸钠作进一步研究。
图2.使用不同泡腾组分制造的药片的主要特性 （A）碳酸氢钠/磷酸二氢钠; （B）碳酸钠/磷酸二氢钠; （C）碳酸氢钠/柠檬酸; （D）：碳酸钠/柠檬酸（提取条件：泡腾片剂量：2片;样品溶液：50mL;提取剂：80L甲苯）。
3.2.2二氧化碳来源和二氧化碳来源
一般来说，通过添加更多的质子供体或更多的二氧化碳源，泡腾反应变得剧烈。为了验证这一事实，我们对磷酸二氢钠（作为质子供体）和碳酸钠（作为二氧化碳源）之间的质量比设定为2：1（基于化学计量），3：1（质子供体源过量），1：1（二氧化碳源过量）。支持信息图S1中的结果表明，当摩尔比为3：1时可获得最佳回收率，但精度相对较差。这表明发泡反应需要适度的条件以获得更有效和稳定的传质。尽管如此，实验过程加上过量的二氧化碳源耗时，超过了30分钟。事实上，碳酸钠和磷酸二氢钠之间的反应是可以产生二氧化碳的酸碱反应。碳酸氢盐首先在底部过量时产生，然后二氧化碳将被收集起来。但是，二氧化碳可以在2：1或3：1的比例下直接产生。
3.3泡腾片的量
原则上，将更多的泡腾剂添加到含水样品中可以产生更多的二氧化碳，以帮助提取溶剂的分散并增强从溶液到提取剂的传质。而泡腾片剂量的增加会导致离子强度和粘度增加，然后由于粘性阻力效应，萃取效率下降[26]。在这项研究中，研究泡腾剂的用量范围为1-4片（产生二氧化碳的量在0.002-0.008摩尔范围内）。
3.4 萃取剂体积和种类
一旦选择了泡腾组分和量，提取溶剂的类型在甲苯，1-辛醇，正己烷，环己烷中进行了研究。如附图S3所示，可以看出甲苯的回收率比正己烷和环己烷的回收率略高，比正辛醇的回收率要高得多。此外，甲苯的粘度低于其他测试溶剂，可使分散迅速，传质效率高。由于高回收率和低粘度，用甲苯进一步提取。为了评估萃取溶剂体积的影响，评估了一系列体积（50,60,70,80,90 L）。可以看出，回收率从50升到60升，在70-80升时达到最大值，此后峰面积减少。考虑到节约溶剂和回收率，采用的甲苯体积为70 L。
图3. GC-MS色谱图和（A）未加标的京杭大运河水样; （二）掺加5克/升腈菌唑，戊唑醇，环氧唑和氟苯唑醇的加标京杭大运河水样; （C）掺加20g / L甲基环丁烯，戊唑醇，环氧卡唑和苯醚甲环唑的京杭大运河水样加标; （D）掺加50克/升腈菌唑，戊唑醇，氧唑菌和灭菌唑的京杭大运河水样加标。 鉴定：（1）myclobu-tanil，（2）戊唑醇，（3）环氧唑，（4）苯醚甲环唑。
3.5方法验证
3.5.1分析性能
为了验证所提出的方法的适用性，在加标蒸馏水中进行了实验，重点是线性范围（LR），相关系数（r），LODs，LOQs，和精确度。 所得结果列于表1中。线性通过提取七种工作水质标准物来确定，浓度为1-100 g / L的霉菌，戊唑醇，环氧唑，苯醚甲环唑。 对于四种三唑，得到的r从0.997变化到0.999。 基于最低样品浓度S / N = 3的方法的检出限介于0.15和0.26 g / L之间。 LOQs范围从0.49到0.86（基于最低样品浓度下的S / N = 10）。 RSD（n = 7）表示的方法重复性在50g / L时在8.9-11.5的范围内，合适的EF在422-589之间。
3.5
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