在高盐度条件下通过添加相容性溶质对厌氧氨氧化活性的增强
Liu Mu、Peng Yongzhen、Wang Shuying、Liu Tiantian、Xiao Han
北京市工程研究中心北京科技大学，北京重点实验室水质科学与水环境恢复工程，北京100124，中国公共关系
摘要
对相容性溶质对高盐度下厌氧氨氧化活性的增强作用进行了研究。所有的兼容溶质（GB，海藻糖和四氢嘧啶）被发现能有效的减轻盐的毒性，甜菜碱（GB）是最有效的。在30g / L的盐度下加入GB使厌氧氨氧化生物被驯化的可能显著增加。在加入理想配比甜菜碱（GB）的反应器（RB）（49天）中的恢复时间比对照反应器（RC）（130天）短2.65倍。在RB中经过49天，胞外聚合物物质和四唑氯化物脱氢酶活性分别为217.9毫克/ gVSS量和38.7微克TF / gVSS量/小时，比RC中低1.86倍和高出3.17倍。 在RB中微生物数量比重等方面具有明显的优势。因此，增加相容性溶质被视为可行的解决方案之一，以抵消盐度对厌氧氨氧化的抑制。
关键词：厌氧氨氧化、相容性溶质、盐度、微生物群落结构
1、简介
厌氧氨氧化（厌氧氨氧化）工艺被认为是一种新的，对环境友好和经济的技术（Jin等，2012）。然而，厌氧氨氧化技术的广泛应用受到长启动周期，在低温，有机物的存在，高盐度和其它抑制剂的限制。含盐废水的高盐源于很多行业可以诱导细胞发生质壁分离或由于渗透压的急剧增加而死亡，从而可能改变活性污泥微生物群落结构的生化特性（Ma等，2012）。
目前，盐水条件下厌氧氨氧化菌的驯化被认为是减少盐抑制的主要方法来之一。卡尔塔尔等 （2006）发现，驯化盐度条件下的厌氧氨氧化菌可用于处理初始NaCl浓度高达75 g / L的废水。然而，刘等人 （2009）报告说，即使使用长期驯化，淡水ANAMMOX污泥不能耐受盐度大于30克/升以上。此外，也有许多工业废水的盐度波动很大，而逐渐和长时间暴露于含盐的废水中使达到高厌氧氨氧化活性必不可少的（Jin等，2012）。
此外，以往的实验已经显示添加相容性溶质（CS），有利于盐度条件下污泥的活性。 CS是低分子量的有机化合物，这样命名因为它们不与有害大分子相互作用。它们能增加细胞的渗透势，并导致维持适当的膨压的（Cyplik等人，2012）。耶尔克斯等（1997）证明CS之一的甜菜碱1mM（GB），可以对高盐的条件下Methanosarcina和Methanosaeta纯培养产生积极影响。 Virides等 （2010）发现，在盐的毒性水平（35克NaCl/升）批次厌氧消化过程中产生的甲烷比当加入GB后高出三倍。然而，就我们所知，没有研究都集中在CS除了关于盐水废水处理的厌氧氨氧化过程的影响。conditions.Vyrides等（2010）发现，盐的毒性水平（35 gNaCl / L）批次厌氧消化过程中产生的甲烷是当加入GB高出三倍。然而，尽我们所知，没有研究集中在CS添加效果对含盐污水处理中厌氧氨氧化过程的影响。
因此，这项工作的主要目的是检验添加CS对与加强盐碱条件下厌氧氨氧化活性的可能性。具体将厌氧氨氧化活性（SAA），脱氮率（NRR），化学计量比，四唑鎓氯化物脱氢酶活性（TTC-DHA）和胞外聚合物质（EPS）列为实验指标，探索反应的可行性和基本机制。此外，利用荧光原位杂交（FISH）来分析性能和微生物群落结构的演变之间的关系。
2、方法
2.1母反应器运行
合成废水根据淼等人编写的。 （2014年）。加入（NH4）2SO4和亚硝酸钠以控制氨氮和NO2 - N分别在200和260毫克/升。从试装置UASB得到厌氧氨氧化生物量用8.45克/升的挥发性悬浮固体（VSS）被引入到密封的SBR（50L）作为母反应器（PSBR）。向该PSBR提供合成废水每日3个循环运行12个月在NRR大于2.0公斤/立方米/天的。初期pH值和温度固定在7.5和33plusmn;1℃。每个循环（480分钟）由10分钟进料，360分钟的混合，40分钟的沉降，10分钟的排水，以及60分钟闲置时间和所述交换量定为25％。
2.2实验设计
在PSBR不同盐度下CS对厌氧氨氧化微生物量的短期影响通过SAA测试以1克/升的VSS进行。基板的初始浓度分别为70 mg/L NH4 -N 和70 mg/L 的NO2minus;-N。根据CS的浓度（0.1,1和5mM），SAA测试被分为三组。通过加入NaCl调节盐度在5以下，各组被分别加入以下CS到所述介质中进行：GB（C5H11NO2），海藻糖（C12H22O11）和四氢嘧啶（C6H10N2O2）。CS由上海生工生物科技（上海）有限公司提供。另外，控制实验在没有加入CS的不同盐度下进行。所有的实验重复三次。
考查CS的长期效应，用两个相同的密封的SBR（6L）从P SBR接种8.26克/升的VSS。两个SBR，一个加入1mM GB（RB）和一个不加任何的CS（RC）的控制反应器，在盐度为30克/升的条件下用相同的合成废水进料并用相同的方式作为PSBR运行181天，为了维持稳定介质，在每个周期开始之前将微生物用合成废水洗涤三次。无论是在短期和长期试验初始pH和温度都固定在7.5和33plusmn;1℃。
2.3分析方法
TN， NH4 -N，NO 2 - N，NO3 - N和VSS根据标准方法（APHA，1998）进行了分析。 SAA是根据唐等人进行的（2009年）。在TTC-DHA根据Filipic等来确定（2012）。使用根据Adav和Lee（2008）加热方式的EPS提取。在EPS碳水化合物采取通过用葡萄糖标准蒽酮方法测定。蛋白质用使用牛血清白蛋白作为标准Lowry法的测定。FISH用EUB338探测所有特殊真细菌，再加上AMX368测定特定的反硝化细菌具体分别为厌氧氨氧化菌和偶氮664，Thau646，Curvi997。样品固定和杂交步骤，如卡尔塔等人描述的方法进行。 （2007）。
3、结果与讨论
3.1不同的CS在不同盐度下对厌氧氨氧化菌的影响
如该图1所示。在低盐（5-10克/升）下添加CS增强效果不明显而在盐度15-30克/升时显著增强SAA。此外，在应对盐度突然增加对厌氧氨氧化菌的影响上GB是最有效的，其次是海藻糖，然后四氢嘧啶。例如，以25克/升的盐度为例，加入1mM的 GB、海藻糖和四氢嘧啶，SAA为12.4，11.8和10.9毫克N / gVSS量/小时，比不加cs增加了将近59.0％，51.3％及39.7％控制（7.8毫克N / gVSS量/小时）。这一理论由Virides等人提出的（2010）。它可以推断GB可能是最容易通过膜输送并被厌氧氨氧化菌吸收，随后海藻糖然后四氢嘧啶。此外，加入1 mM GB（图1（b））对减少盐抑制与加入0.1毫GB相比有更积极的作用（图1的（a）），但是，用5mM GB没有观察到进一步的明显促进了（图1的（c））。从而1mM的GB的添加可以被选择用于将来的实验。
Fig. 1.
SAA of anammox biomass at different salinity with (a) 0.1 mM, (b) 1 mM and (c) 5 mM of GB, trehalose and ectoine added.
3.2、30g / L盐度条件下GB对厌氧氨氧化菌的长期影响
3.2.1 NRR
RB和RC的NRR都表现出急性下降，然后淡水的和适应高盐度的厌氧氨氧化逐渐恢复（图2的（a））。然而，在具有49天RB中的恢复时间与130天比较短2.65倍。49天后，RB具有NRR2.16公斤/立方米/天，总氮的去除率和VSS 分别为84.3％和7.28-7.71克/升，而RC具有NRR0.68公斤/立方米/天，总氮的去除率和VSS分别为36.8％和RC5.98克/升（图S1）。因此，添加GB能导致在驯化时间显著减少。因此，GB这是一种相对便宜的CS，可以消耗较少的时间，比废水广泛稀释，或在较长的时间段逐渐驯化更加实用。
3.2.2化学计量比
RB和RC的化学计量比NO2minus;-N转换为NH4 -N消耗量（RS）和NO3—N产生NH4 -N的消耗量（RP）波动随着时间的推移如（图2（b）段）。并且在两个反应器中分别观察到了比理论水平（1.32和0.26，）更高的RS和更低的RP。在抑制的条件下，细胞衰变和裂解总是发生，并导致水溶性有机碳和过量的氨产生（Dosta等人，2008）。在这种情况下，反硝化最有可能使用的电子供体来源于厌氧氨氧化的衰减，以减少亚硝酸盐和硝酸盐的发生。此外，EPS是需要厌氧氨氧化在高渗透压环境中生存，并由EPS代替细菌生长的合成消耗，这将在第3.2.4节中讨论。这可能是硝酸盐形成少的另一个因素。 GB，作为一种有机物质可以为反硝化菌的电子供体，从而经过130天，RP在RB比在RC低一点点。然而，在RB和RC中 RS方差（CV）的系数分别为0.034和0.061，而在RB和RC 中RP的CV分别为0.122和0.228（表S1）。总体上来说有使用RB比RC更稳定。
3.2.3 TTC-DHA
TTC-DHA的变化趋势是与NRR中的RB和RC一致（图2的（c））。经过49天，在TTC-DHA在RB（38.7微克TF / gVSS量/小时）较RC水平（12.2微克TF / gVSS量/小时）高出3.17倍。绝大多数在生物体的氧化还原反应的是脱氢酶和氧化酶的催化下，而脱氢酶，作为一种胞内酶的与细胞内的氧化磷酸化过程密切相关，并为反应微生物活性的一个重要指标（Filipic等人，2012）。因此TTC-DHA的结果进一步证明了厌氧氨氧化活性通过加入CS在高盐度条件下的提高。
3.2.4 EPS
如从图中可以看出。图2（d），在这两个RB和RC的EPS（蛋白质和多糖）随着时间增加，然后下降。然而，在整个过程RB中的生物量与RC相比低得多。经过49天，在RB的EPS（217.9毫克/ gVSS量）比在RC水平（406.2毫克/ gVSS量）低1.86倍。微生物产生更多的EPS使它们在有毒物质，包括高盐存在下存活，而EPS的量在一定程度上暗示了厌氧氨氧化菌的活性（Jin et al.，2013）。
符合含有GB的介质中，从所述介质中摄取生物能量合成EPS和微生物消耗更少的能量合成EPS以抵消高渗透压环境（Vyrides和斯塔克，2009）。因此，加入GB这是当微生物在适应较高盐度NRR一个重要因素。
Fig. 2.
Variations of (a) NRR, (b) stoichiometric ratios, (c) TTC-DHA and (d) EPS over time in RB and RC.
3.3、微生物群落结构的演变
综合来看，在厌氧氨氧化菌百分比（ABP）在这两个RB和RC（表1）中随着厌氧氨氧化菌的高盐度驯化使盐抑制降低。然而，ABP在RB的递减比在RC低和前者恢复时间比后者短。厌氧氨氧化活性的下降导致了水溶性有机碳，而反硝化细菌可以使用有机碳作为电子供体。因此有一个在反硝化细菌的百分比（DBP）的增大。与此相反，当厌氧氨氧化活性增加，较少的电子供体是来自厌氧氨氧化的衰减的，因此有一个在舒张压的降低。从第1天至90天舒张压在RB比在RC较低，其中可能与厌氧氨氧化在RB中的较少衰减有关。 90天后，舒张压RB较RC部分略高归因于GB引起的脱硝。就整体而言，RB拥有微生物数量比重等方面明显的优势。
4、结论
相比海藻糖和四氢嘧啶，对于厌氧氨氧化菌抵抗毒性钠， GB是最有效的。 1mMGB的添加可以提高厌氧氨氧化菌的盐度驯化电位与化学计量比的小的波动，由更高NRR，更高TTC-DHA和低的EPS生产所反映。当GB存在于盐水中对微生物生长具有明显的优势。添加CS可以在高盐条件下提高厌氧氨氧化性能。
致谢
这项研究是由中国自然科学基金（21177005）和科研基地和北京市教委科技创新平台项目的支持。
附录A补充资料
与本文相关的补充数据可以发现，
在网络版，在http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech。
2014.06.015
参考文献
Adav, S.S., Lee, D., 2008. Extraction of extracellular polymeric substances from
aerobic granule with compact interior structure. J. Hazard. Mater. 154, 1120–
1126
APHA, 1998. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater.
American Public Health Association, Washington, DC, USA.
Cyplik, P., Piotrowska-Cyplik, A., Marecik, R., Czarny, J., Drozdzynska, A.,
Chrzanowski, L., 2012. Biological denitrif
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