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固体停留时间和碳储存对微藻通过Diel循环回收氮磷的影响
- A.Gardner-Dale，I.M.Bradley，J.S.来宾，伊利诺伊大学厄班纳分校，205号N.Mathews Avenue，Urbana，IL，61801，USA)
摘要
微藻处理系统可以通过在现有技术限制下达到有效氮和磷水平来促进废水中的养分回收，但要想实施这些系统，就需要了解它如何决定如何影响日常循环中的养分吸收。通过固体停留时间(SRT)提高微藻N：P的回收率，同时通过碳的储存和转移，在昼夜循环中保持对养分的完全去除。在光生物反应器中，对两种微藻进行了光生物反应器模拟自然光循环的化学调节实验，其滞留时间分别为6到22天和7到13天。在所有试验中，营养负荷和所有其他因素都被固定。升高的固体停留时间(gt;8天)使养分浓度(N或P)在整个Diel循环中低于检测极限。藻类生物量中N：P质量比与SRT呈线性关系，在9.9：1~5.0：1和4.7：1~4.3：1之间变化。在所有试验中，生物量碳水化合物含量在高辐照度下增加，在低光照和黑暗下降，而在24小时循环中脂类动态最小。在所有营养有限的培养中，碳水化合物通常随着SRT的增加而下降.夜间消耗储存的碳水化合物促进了营养素的摄取，使整个晚上的营养完全受到限制。营养同化的动态碳水化合物消耗与蛋白合成一致，但低于异养生长，这说明在低/无光照时期，藻类过程模型需要将生长与养分吸收分离。利用传统的工程过程控制(如SRT)，设计微藻N：P吸收比和优化储能代谢的能力，可以使先进的养分回收设施达到氮磷连续、可靠的双重限制。
1.介绍
引入养分管理是21世纪污水工业面临的重大挑战。人为氮(N)和磷(P)释放对水生环境的长期有害影响是不可否认的，规模从接收河流的富营养化到切萨皮克湾的恶化和墨西哥湾低氧区的形成。此外，营养污染最近被确定为美国水域损害的主要原因，其破坏性影响每年都在增加。因此，在整个美国，有效营养限度变得越来越普遍和越来越严格。作为水资源回收设施，有必要制定符合环境和经济目标的替代养分管理战略。
传统的WRRF养分管理方法依赖于昂贵的能量密集型过程，将磷酸盐转化为聚磷酸盐或金属-磷酸盐沉淀，从而实现养分的去除或向下循环。我国应用新的处理系统去除有机氮、磷，但是仍然导致藻类生长。溶解的有机氮和磷可以通过物理过程分离，但现有的这些工艺是能量密集型和昂贵的。用更常规的方法将无机磷去除的技术需要高成本，要求金属盐添加的量增加。因此，发展一种用于经济养分回收的新型生物工艺，有机营养部分的回收是必要的,以满足越来越有效有质量目标来保护接收水环境。
微藻已经发展为在营养耗尽环境中竞争氮和磷，具有高的最大摄取率，它们通过特殊方法快速吸收有机磷和有机氮，这表明它们在生物化学养分回收过程中是有效的。特别是，微藻已经用于营养去除。此外,微藻类工艺具有处理氨的潜力,并且在WRFS的富磷区进行厌氧消化，但必须克服更高的浊度和生化需氧量。微藻类系统也产生可进入市场作为肥料和生物能源原料，提供市场额外收入和改善金融活力。特别是微藻储存有机碳的能力,（作为脂质和碳水化合物）推动了主要的研究工作其用于生物燃料生产。同样的是,对于养分回收系统来说,能力也是有利的，因此，在不存在外源的情况下，通过平稳的生长，营养物可以在夜间摄取能源。耦合的微量藻类养分回收与生物质生产技术研究从第1段转化营养管理流程从生物原料中去除能量要求高的污染物的产生弹性养分回收。到目前为止，藻类的使用废水处理在很大程度上限于氧浓度。尽管最近高速率藻类池塘、附着生长桨的发展车轮系统，以及密集的管式光生物反应器(PBR)系统培养微藻类用于养分回收。关键的是对提高强化藻类处理系统的挑战，然而，对于强化藻类处理系统的发展来说，一个关键的挑战是缺乏对如何设计和操作系统的机械理解，这些系统能够在日常和季节性周期内可靠地达到特定地区有效的质量要求和生物量生产目标。
微藻类技术的历史研究与应用通常假设微藻化学计量为N∶P为7.2∶1。然而，最近的研究强调了内部电位化学计量变异化性。特异性N:P变化是不同的生长机制和要求的结果，了解种内化学计量的影响因素变化需要更密切的调查研究。氮磷变化有两种主要机制：微藻N:P含量。首先，已显示N:P随生长速率可重复地变化：由结构的化学计量所引起的容纳生长所必需的氮磷变化。第二，n：p变化性在以下观察到：其中一种或两种常量营养素过量的摄取，但该机制可能不是像先前所认为的普遍存在的。上述结构可变性可以被广义地观察到，还没有在与生长条件相关的生长条件下对微藻进行检查。对增长率和N:P要求的调查在0.5到4天的范围内检查保留时间；其他物质保留时间最多7天。然而，为了实现财务可行性，更长的时间可能需要固体停留时间（SRTS）活性生物质浓度，强化藻类处理方法，并减少水力停留时间(水力停留时间)和设施占地面积。此外，夜间养分吸收实验，是要屏障微藻类养分回收系统的应用中不存在的外源性能量。因此，需要理解的是，实际Diel循环对养分吸收的影响及在一系列SRTS中生化组合物。这项工作的目的是研究WRRF相关SRTS和碳存储聚合物（碳水化合物和脂类)对微藻的氮和磷的吸收。桦褐孔栅藻的分离单细胞，在通常被发现在废水中生长的属中和衣原体，其特征为绿色藻类,选择为模型生物。当每个反应器的营养负荷保持恒定时,为了模拟固定的水力停留时间，改变了稀释率，使其分离，SRT对养分吸收和碳动力学的影响。完成后获得稳定状态，收获生物质并进行分析在整个24-H周期内，阐明生物量N：P的趋势，以及生化成分，包括储存和动员碳储量。
2.材料和方法
2.1光生物反应器
平板反应器是为在受控条件下进行实验室规模试验而设计的.用蓝色(460 Nm)和红色(630 Nm)发光二极管(LED)从一侧照射PBR，并通过微控制器调节光源调节光强。一个内部尺寸为25毫米x 254毫米x 737毫米的聚氯乙烯框架支持两个透明的丙烯酸面板，侧壁孔用于曝气，pH监测(精确的trade;pH探头，费舍尔科学)，取样，以及顶孔的尾气，充气和喷流。通过水使所有充气气流加湿，以减少蒸发损失。加湿后，所有气体在通过扩散器进入反应器之前都是经过过滤的。为了帮助防止pH抑制和碳限制，pH保持在7.25至7.75之间，在pH高于7.75时，将二氧化碳引入曝气线。
2.2接种体
为了特别关注藻类培养对SRT的响应和减轻危害因素，本研究采用纯培养法。从得克萨斯大学藻类培养库中分离得到两种微藻，分别培育为斜纹衣藻和斜纹藻。用DNA自旋提取土壤试剂盒提取DNA，用真核特异性引物EukA、EukB和563 f进行Sanger测序，并利用BLAST进行物种鉴定。
2.3.培养条件
在14h正弦光重复循环下，在化学调节剂中培养斜纹链霉菌，然后在10小时黑暗中重复培养。每个反应器通过恒定的充气流量和过流量保持恒定的HRT和容积，从而保持恒定的养分供应速率(以mg/L为单位)。不采用固液分离，为了模拟增加SRT的效果，斜纹线虫和莱茵氏菌的滞留时间不同，养分负荷维持在12.5至13.8 mg N/L之间。N：P比值为7.84：1，尽管由于可达到的抽水速率设定点，营养负荷略有变化。改良的自来水介质含有改良的微量金属，不含乙酸，也没有缓冲液。选择铵作为氮源的原因是，原水、侧流和短时SRT活性污泥流程中的氮极有可能以还原形式存在。无机碳是通过注射器泵以183毫克NaHCO3/L的速率供应的。当CaCO3/mg N达到8.6到9.4mg时，PBR内部无菌刮除抑制附着生长。
2.4连续操作
每个反应器运行到稳定状态，在连续三天的光循环中，光密度在735 nm处的变化小于5%。采样是在确定稳态后开始的，通常需要3到4 SRT(且始终大于2.5SRTs)才能连续工作。细胞悬液用戊二醛固定，保存在4℃，在取样前通过显微镜检查污染情况。对于Diel采样，每2 h从反应器中抽取约240ml，每24小时一次，并调整充气和流出泵速率，以保持保留时间和负载率。在从反应器中移除样品时也进行了固体分析。其余样品在7000℃离心10 min，上清液经预漂洗，滤膜过滤颗粒生物量被冻结在20℃，冷冻干燥，室温干燥保存。过滤上清液被冷冻在20℃直到分析为止。
2.5.悬浮固体和水分分析
样品的总悬浮物经预冲洗、预燃、预重0.7 mm玻璃纤维滤光片，105℃加热1h，称重前烘干30分钟。在烘干和称重前，在550℃松饼炉中燃烧20 min，三份测定挥发性固形物。通过在105℃加热前后和室温干燥30 min后称重，确定生物量占水分的百分比，发现生物量是生物的重要组成部分。
2.6生物质元素分析
用Perkin Elmer 2400系列CHNSO元素分析仪测定了总元素碳、氢和氮。用Perkin Elmer SCIEX Elan DRC-e ICP-MS法测定总元素磷。这两套元素分析是由伊利诺伊大学厄巴纳-香槟化学学院的微观分析实验室对冷冻干燥的生物量进行的。
2.7.脂质
粗脂测定采用Folch法改进为一步提取。将约25 mg生物量悬浮在2：1氯仿：甲醇溶剂混合物的6mL中，每15到20 min一次，摇匀1h，在350 g离心2 min后，将脂质相注入预称铝盘中，进行蒸发和重测定。所有生物量样品一式两份，但在SRT为10天的单一样本中，由于生物量不足，不做记录。
2.8.碳水化合物
采用两步酸水解和半定量比色法测定了冻干藻生物量的总碳水化合物含量。在72%硫酸作用下，在30℃下孵育1h，每15 min旋涡一次，稀释至4%，再在120℃高压釜中孵育1h，再用NaOH中和水解液，离心后用3-甲基-2-苯并噻唑啉酮水合物和二硫苏糖醇加热。在随后的稀释后，根据在630 nm处的吸光度，对单糖浓度与葡萄糖标准进行定量比较。
2.9蛋白质
干重作为蛋白质的百分比是通过将总元素氮(作为生物量的重量百分比)乘以蛋白质转化率来确定的。通过对氨基酸残基的分析，确定了氮到蛋白质的转化率，为蛋白质的测定提供了一种可靠的方法。对隐翅虫来说，转换因子为4.94g蛋白质/gN。
2.10磷酸盐
用抗坏血酸法对邻菲林的滤液进行了三份分析，并对微板进行了改进。样品与硫酸、钼酸铵、酒石酸锑、抗坏血酸反应15 min，在微板分光度计上，三份测定得到蓝色磷钼酸。检出限为0.011 mg P/L。遵循以前规定的程序，用上述方法分析了9个相同浓度的重复，并确定MDL为t值的乘积和样品的标准差。当计算出的MDL大于所使用的峰值10倍时，结果被接受。
2.11氨
用苯酚法对过滤上清液中可溶性铵进行了三份分析，并对微板进行了改进。以硝普钠为催化剂，与苯酚、柠檬酸钠和次氯酸钠反应制得苯酚。在640 nm处测定三份样品的吸光度。方法检出限为0.012 mgN/L。
2.12统计分析
图基的测试被用来比较不同处理的微藻培养的表现，以确定变异是否比随机误差预期的要多。各组均进行方差正态性和均匀度检查。分析的结果表示为平均值和最大数据点之间的差值。
2.13黑暗期间呼吸模型
在黑暗时期，碳水化合物的动员是用以下方程式计算的：
其中x是蛋白质合成的成本，y是在黑暗中以碳水化合物的形式从被动员的碳水化合物中合成的蛋白质的产量。
3.结果与讨论
3.1 N：P生物量比
N：P生物量比与SRT的增加呈负相关，分别为9.9：1~5.0：1和4.7：1~4.3：1。从坡度大小可以看出，斜纹线虫N：P比的可塑性要大于斜纹瓢虫的N：P可塑性。线性趋势的一个例外是斜交链球菌最长的SRT(21.8天)，为5.3：1，与17.5天观察到的最低N：P比值5.0：1无统计学差异。这些数据表明，斜纹丝虫的最小N：P质量比约为5.0：1，其最小质量比为4.3：1。在这个范围内的最小N：P比值是合理的，因为富P核糖体是细胞内结构的主要吸收物，N：P比为3：1，细胞需要其他富N组分才能发挥作用。
当SRTs大于8天的所有反应器在整个Diel循环中都没有检测到本体液相中的氮或磷时，其养分限制就不存在了。因此，这些系统中的微藻可将所有有效氮或磷回收到MDL以下，生物量N：P比值大于或低于膨胀流N：P比值7.84的培养分别受到氮或磷的限制。然而，N：P所有观察到的营养条件下呈现线形的，都是斜纹丝虫和白僵菌。据作者所知，这是首次在超过7天的多个极限条件下实验观察到这种线性关系，它只在双重限制下被模拟。
生物量N：P比对SRT的依赖性与建立细胞生长速率与细胞化学计量学之间的联系是一致的。这种关系被称为生长率假说，将碳同化所需的细胞成分与构成它们的营养素联系起来。这些成分是氮和磷的主要汇，并以一定比例存在于细胞中，以适应特定的生长速度。随着生长速率的变化，这种细胞机器对结构氮和磷的需求也会发生变化。在N：P质量比为4.3：1~22：1的条件下，微藻的结构氮、磷含量可能与氮磷比相匹配，具有双重限制。这一双重限制点被称为临界比，这是微藻对结构氮磷的需求。当膨胀的N：P比值完全符合化学计量要求时，可以观察到临界比，从而阻止了储存微量营养素的奢侈摄入。虽然本工作中的实验并不是为了测量临界比而明确设计的，但随着SRT的增加，N：P比值的线性下降表明，微藻结构氮磷的需要量可以与不同物种的氮磷比从4.3：1提高到9.9：1。
因此，微藻化学计量比对生长速率的影响是一种生物现象，可用来调节废水处理过程中微藻生物工艺的N：P回收率。事实上，可以设计某一藻类养分回收系统的SRT，使微藻临界比等于养分供给比，使工艺工程师和操作人员能够在WRRFs上实现氮磷双重限制。
3.2碳水化合物储存动力学
24小时取样可以在模拟的Diel循环中分析生化和营养动态，然后可以比较不同SRTs的每日趋势。脂肪和碳水化合物的含量被归一化为蛋白质，以更准确地描述储存产品的动态。在所有的实验和取样点
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