印染废水处理系统中微生物群落的演变外文翻译资料

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印染废水处理系统中微生物群落的演变

Qingxiang Yang*, Jia Wang, Hongtao Wang, Xuanyu chen, siwei Ren, Xueling Li, Ying Xu, Hao Zhang,Xuemei Li

摘要 在这项研究中，使用培养和分子生物学技术追踪了全尺寸印染废水处理系统的两阶段生物过程中细菌，真菌和古菌种群的动态。计数结果表明，细菌是该系统中的主要流行，其中所有处理单元中真菌与细菌的比例均下降，而古菌与细菌的比例显着增加，尤其是来自第二阶段生物逻辑处理过程的样本。PCR-变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析表明，系统启动时微生物多样性随系统运行而增加，系统启动时接种污泥中64.6％的细菌，57.6％的真菌和38.2％的古菌种群保留在系统中。尽管微生物群落和流入物的组成存在差异，但一些细菌物种如Thauera sp。在所有收集的样品中同时存在黄单胞菌和黄单胞菌科。

关键词 古菌 细菌 变性梯度凝胶电泳（DGGE） 真菌微生物群落 印染废水

1.简介

在中国，各种含染料的废水占工业废水近30％，其中印染废水（PDW）是最重要的废水之一。PDW通常具有较低的BOD₅/COD比率（5天生化需氧量/化学需氧量，约20％），高pH值（10-13)，并含有毒，经常变化和生物顽固的组分，如染料和染色添加剂（聚乙烯醇，PVA）（Wu等，2007）。虽然目前中国对这种废水的处理是物理化学和生物过程的结合，但各种生物学方法起着核心作用，能够去除40-50％COD和50-60％的色度（Hou和Yu，2004）。然而，在系统启动或系统运行期间，经常发生活性污泥浓度降低，污泥膨胀和大量泡沫等重要问题导致处理效率严重下降甚至系统崩溃。

在大多数当前的工业废水处理厂中，通常从市政废水处理厂收集成熟阶段的接种污泥作为接种物。在适应新的废水环境期间，这种污泥经历了微生物群落结构的显着变化，这有时导致系统启动失败。假设主要微生物在系统的每个阶段都发挥着最重要的作用，澄清生物处理过程中的主要微生物组成及其在系统运行中的演化可能有助于理解和解决上述问题。提到的问题。以前许多关于微生物群落动态的研究都集中在功能稳定性和群落稳定性之间的关系，或环境条件对微生物群落结构的影响，以及处理合成废水的实验室规模生物反应器中的关系（Liu等，2011; Hai等，2011）。我们之前关于富含碱性细菌培养物在两个不同的实验室规模反应器中处理真实PDW的能力的研究表明，微生物群落在操作过程中经历了显着的变化而不影响处理效率，并且很少有细菌物种从富集的种子中分离出来的培养物可以在稳定运行的生物反应器中检测到（Yang等，2011）。然而，只有少数研究报道了大规模家庭或工业废水处理系统中的微生物群落动态（Lapara等，2002; Wang等，2011），特别是微生物群落从接种污泥到用于全尺寸PDW处理系统的稳定运行污泥。由于PDW的频繁变化的特征和复杂的组成，PDW处理系统的设计和操作对于理解微生物群落动态与系统启动和稳定运行之间的关系更为重要。本研究采用聚合酶链反应-差热分析（PCR-DGGE）和rRNA基因测序方法，在一套完整的PDW生物处理系统中，对细菌、真菌和古细菌三类微生物的进化过程进行了跟踪研究。本研究结果有望为进一步研究微生物种群在污水处理系统中的作用奠定基础。

在本研究中，PCR-GGE和rRNA基因测序方法用于在建立和调试期间在全尺寸PDW生物治疗系统中追踪三种微生物，细菌，真菌和古细菌的进化过程。预计该研究结果将成为进一步研究污水处理系统中微生物种群功能的基础。

2.方法

2.1废水特性及处理系统

从成立的处理系统一开始，新乡联达印染有限公司（中国新乡）就PDW的特点和生物废水处理系统的性能进行了半年以上的持续监控。使用标准方法（Taras，1971）测定COD、BOD₅、色度、悬浮固体（ss），总氮（TN），总磷酸盐（TP），NH ₄-N和pH的浓度。该公司每天排放500吨的废水，颜色经常由棕变为深蓝，绿，灰、黑。废水特性如表1所示。

表1 PDW的主要特点

废水处理系统于2009年10月建成。该系统由混凝沉淀单元、工艺1（厌氧水解酸化单元（H1）、好氧活性污泥处理单元（O1）、沉淀池1）和工艺2（厌氧水解酸化单元（H2）、好氧生物接触氧化单元（O2）以及沉淀池2）等两级生物处理工艺组成，如图1所示。在系统启动阶段，将市政污水处理厂收集的活性污泥接种到O1中，得到最终的ss浓度4-5g l^-1。低通气约一周后，按表2所示操作O1。沉淀池1中的污泥返回到H1。在O1后23天，通过接种我们之前已经富集并报告的1000升混合脱色酵母培养物（Lu等，2009），来自沉淀池1的部分污泥和来自相同市政废水的部分污泥，开始H2处理厂为O1。从第23天到第29天，O2在低曝气条件下操作，来自H2的污泥在此富集，形成生物膜。启动后，整个系统在表2所示的条件下运行。

图1 PDW处理工艺流程图（H1，厌氧水解酸化装置；O1，好氧活性污泥装置；H2，厌氧水解酸化装置；O2，好氧生物接触氧化装置）

表2 PDW处理系统的主要运行参数（HRT，水解保留时间；DO，溶解氧浓度；T，温度）

2.2污泥样品

在系统启动后（第23天为O1和H1；第29天为O2，第29天为O1和H1；第185天为O2和H2），在上述生物处理装置的不同运行阶段，即接种污泥（分别为第1天和第23天为O1和H2），分别采集污泥样品。将部分样品放入无菌聚丙烯管中，立即进行微生物计数处理。另一部分进行了分子分析，即从不同处理罐中提取的样品在12000转/分下在4℃下离心10分钟。用磷酸盐缓冲液（pH7）洗涤两次颗粒（每10分钟离心12000转）并储存在20℃进行分子分析。

2.3 DNA提取

使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法从污泥颗粒中提取总DNA（Zhou等，1996）。通过琼脂糖凝胶电泳（1% W/V琼脂糖）和溴化乙锭（EB）染色后的UV可视化测定粗或纯化DNA的产率和碎片。纯化后的DNA在20℃下保存，用于PCR-DGGE分析。

2.4微生物种群的量化

通过培养和实时PCR方法进行不同微生物种群的定量。 对于培养计数，细菌和真菌的浓度分别通过改良的平板稀释技术在肉蛋白胨琼脂和马丁琼脂上测定（Carter，1993）。 将所有琼脂平板在室温下孵育。 细菌在1-2天后计数菌落，真菌3-5天后计数菌落。 基于三次重复的平均值确定每组微生物的菌落数。

利用引物对、338F（5＇-CCTACGGGGcaGcG）和518R（5＇-ATTACCGCGGCTGCTGG）对细菌、真菌和古细菌种群进行实时PCR定量；FF390（5＇-CGATAACCGAGCGACCT）和FR1（5＇-AICCATCATCGGTAIT）对真菌进行定量；ARC344F（5＇-ACGGGGYGCAGGCGA）和519R（5＇-TTAACCGCGGGCGCGGCTG）对古细菌进行定量（Overas等，1997; Taina等，2001; Reging等，1998）。PCR在95℃下进行30秒，40个变性循环（在94℃下5秒），退火（细菌为63℃，真菌为60℃，古细菌为65℃），熔点曲线分析为60-95℃，每0.5℃读板一次。使用sYbR绿色检测系统和sYbR预混物EX Taq^TM试剂盒（Takara，中国）按照制造商的说明在ABI 7500Q-PCR机器（USA）上以25mu;l的体积进行实时PCR测定。将扩增的16s rRNA或18s rRNA基因转化到大肠杆菌DH5-alpha;的质粒中。使用具有10³-10⁸个基因拷贝ul^-1的连续稀释的质粒DNA制备标准品。使用熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳确认扩增产物的特异性。对三个重复DNA样品中的每一个进行两次独立的实时PCR测定。通过绘制阈值循环值对基因拷贝数的log₁₀来产生标准曲线（Gutieacute;rrez等，2004）。

2.5微生物种群的PCR-DGGE分析

为了进行细菌DGGE分析，我们用338F-GC（5＇-CGCCC-GCCGC-GCGGG-CGGGG-GCACG-GGG-ACTCC-TACGG-GAGGC-AGCG3）和518R（5＇-ATT-ACC-GCG-GCT-GG-3＇）引物在该引物下扩增了16s rRNA基因的v3区。PCR条件为95℃持续5min，10个变性周期（94℃持续1min），退火（65℃持续45 s，每秒钟降低1℃，直到在55℃接触，72℃持续90s），20个变性周期（94℃持续1min），退火（55℃持续45s，72℃持续90s），最后在72℃延长7min（Muyzer等，1993）。

为了进行真菌种群分析，在95℃的条件下，用FF390（5＇-CGATA-ACGAA-CGA-CCT-3＇）和Gc-FRL（5＇-CCCCC-GCC-GCC-GCGGG-CGGG-CGGG-GCCG-AGCCG-AICCA-TCGGT-AIT-3＇）的引物在95℃的条件下扩增18s rRNA基因8分钟，30个变性周期（95℃为30s），退火（50℃为45s,72℃为120s），72℃下延长10分钟（Vainio和Hantula，2000）。

为了进行古菌群分析，在94℃的条件下，使用古菌16s rRNA通用引物ARC344F-GC:5＇-CGC-CCG-CGC-GCG-GCG-GGC-GGG-GCG-GGG-GAC-GGG-GGGG-CAG-GCG-CGA-3＇和519r:5＇-GWA-TTa-CCG-GG-CG-CTG-3＇进行5分钟的PCR，10个周期的变性（94℃30 s），退火（61℃30 s降低每隔一个周期1℃，直到在51℃下触地，72℃持续30 s），20个周期变性（94℃持续30 s），退火（56℃持续30s，72℃持续30 s），并在72℃下延长30 min（Yu等，2008）。

上述细菌、真菌和古细菌PCR产物分别直接用于DGGE分析。使用D-代码通用突变系统（bio-Rad 实验室，Usa）进行DGGE，细菌和古细菌

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