N-（2-羧乙基）壳聚糖的抗氧化和抗诱变活性外文翻译资料

 2022-03-11 10:03

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N-（2-羧乙基）壳聚糖的抗氧化和抗诱变活性

摘要

具有三种不同取代度的壳聚糖的新型羧乙基衍生物的抗氧化和抗诱变活性已经在体外受到遗传毒性剂吖啶橙和氧氟沙星作用下的单细胞鞭毛虫中测定。结果显示壳多糖衍生物对这两种诱变剂都表现出浓度依赖性的抗遗传毒性活性。研究表明，在氧氟沙星诱导的DNA损伤的情况下，不同的机制可能参与其保护作用-抗氧化活性，以及与细胞膜可能的相互作用，从而防止吖啶橙到达遗传隔室并且随后通过插入结合破坏DNA。在分光光度测量的基础上，将吖啶橙直接吸附在壳聚糖衍生物上，排除了可能的保护机制。所研究的壳聚糖衍生物的抗诱变性对取代度的依赖性在涉及吖啶橙和氧氟沙星的实验中是相反的，也在参与这两种情况中表现不同的保护机理。

关键词：羧乙基化;壳聚糖; 纤细裸藻;氧氟沙星; 吖啶橙;抗氧化剂;抗诱变

引言

壳聚糖是由通过beta;-（1,4）糖苷键连接的D-氨基葡萄糖单体组成的线性同多糖。它可以很容易的通过甲壳素（一种N-乙酰氨基葡萄糖通过beta;-（1,4）连接而成的聚合物）碱性条件下N-脱乙酰反应获得,由于不完全脱乙酰作用,商业上生产壳聚糖可能含有残留N-乙酰基,其的特点是乙酰化作用的程度(DA)反映了数每一个单体N-乙酰糖单元的数目。甲壳素是地球上仅次于纤维素的最丰富的多糖，它包含在真菌的细胞壁、昆虫的外骨骼和甲壳纲动物［5］。后一个储存库是全球工业生产甲壳素的主要来源［34］，其年产量已达到1010-1011吨［10］。在过去的几十年里，甲壳素和壳聚糖在农业，纺织和造纸工业，化妆品，废物处理和食品加工领域有着广泛的应用。考虑到最近发现的这些多糖的抗氧化和抗诱变性质［26,28,31,48］以及它们具有生物相容性，完全可生物降解和无毒性的事实，甲壳素和壳聚糖的衍生物在人类医学和药学中的可能应用引起越来越多的研究人员的关注［10,29,40］。

不幸的是，甲壳素在水溶液中的完全不溶性和壳聚糖在pH低于6.0的溶液中溶解度有限，使得这两种聚合物在其纯非衍生物形式中不适用。由于这个原因，开发合适的程序来制备甲壳素和壳聚糖水溶性衍生物，使其能在植物保护到人类医学临床管理的大规模的应用中使用切实可行，已经有了很大的努力［5,10,44］。

在本文中，我们对新合成的N-羧乙基壳聚糖（CE-壳聚糖）衍生物的抗诱变特性进行了研究，并提出了抗氧化剂和膜结合机制的参与起保护效果的证据。

具有不同取代度（DS）的CE-壳聚糖对氧氟沙星和吖啶橙（AO）的遗传毒性的可能的抗诱变活性在纤细裸藻抗突变性测定中进行了评估。 光合单细胞鞭毛虫纤细裸藻拥有一个包含核，线粒体和叶绿体DNA的多基因组系统。叶绿体基因组对可以导致降解或完全丧失叶绿体DNA的各种化学和物理因素特别敏感［19,20］。叶绿体基因组之所以成为诱变物的优先目标，其中一个原因是，有效“包裹”真核细胞细胞核DNA的组蛋白不存在生在半自主细胞器中。叶绿体DNA类似于线粒体DNA或大肠杆菌和蓝细菌的DNA仅被少量的组蛋白样蛋白稳定，因此通常被描述为“裸”，因此与核染色质不同。此外，叶绿体缺乏切除修复系统，另一方面，重组修复机制在很大程度上参与了诱变。 与核DNA相比，叶绿体DNA具有更快的周转率。

在纤细裸藻的真核细胞中，叶绿体可能代表某种类型的“模式细胞内细菌”，用作复杂细菌诱变试验的基因毒性指标，如带有代谢活化的艾姆斯试验或所谓的“宿主介导测定”。 考虑到将获得的结果外推至人类对象，与体外细菌测试相比，纤细裸藻具有明确的优势，因为与细菌相反，人类和纤细裸藻均表示真核模型，因此具有共同或非常相似的代谢活化，解毒，膜运输等。

功能性叶绿体的遗传丢失是由异养无色菌落的形成证实的。我们最近发表的研究成果已证明裸藻是一种便于研究诱变和抗诱变的真核生物模型［9,19-24］。

实验过程

化学药品 氧氟沙星购自斯洛伐克共和国的斯洛伐克赫斯特抗生素公司；吖啶橙（AO）购自德国斯坦海姆的奥德里奇化学公司；奎诺二甲基丙烯酸酯/水溶性维生素E[（R）-6-甲氧基-2,5,7,8- 四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸]购自英国多塞特吉林厄姆的奥德里奇化学公司，用作标准抗氧化剂。从英国多塞特普尔的西格玛奥德里奇公司获得2,2#39;-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS）和过硫酸钾。用于制备CE-壳聚糖的3-氯丙酸购自德国陶夫基兴的Fluka公司。

氧氟沙星的新鲜溶液通过在0.1M氢氧化钠中溶解制备。AO溶解在二甲基亚砜中，并CE-壳聚糖样品溶解在无菌蒸馏水中。

CE-壳聚糖钠盐的制备 在碳酸氢钠存在下，用3-氯丙酸在水中处理来自粗碎蟹(奥德里奇, 44,886_9),的低分子量壳聚糖，分子量150000，并且如Skorik等人所述的方法进行产物的分离和纯化。由他们的1 H-NMR光谱［36］，测定制备的衍生物的取代度（DS-壳聚糖的氨基的烷基化）。 元素分析使用卡劳尔巴EA 1108分析仪进行(意大利，罗达诺)。

图1.壳聚糖与3-氯丙酸的N-羧乙基化示意图

纤细裸藻诱变试验 纤细裸藻菌株Z来自美国纽约州佩斯大学哈斯金斯实验室的S.H.Hutner博士的慷慨赠与。如前所述培养细胞并评估漂白突变体［21］。在27℃和2000lx的恒定光下，在添加或不添加CE-壳聚糖样品的条件下，用5mu;g/ml的AO或15mu;g/ml的氧氟沙星共同处理裸藻细胞样细胞。 24小时共处理后，将细胞洗出，稀释，并铺在克莱默梅尔斯培养基（1.2％琼脂）［6］的琼脂培养基培养。在27℃下光照培养10-14天后，分析绿色（正常）和白色（突变体）菌落。使用各种DS的CE-壳聚糖样品，浓度如下：10,50,100和200mu;g/ ml。使用不添加AO或氧氟沙星的CE-壳聚糖样品的溶液作为对照样品。在每个CE-壳聚糖浓度的每个培养实验中均使用3个培养皿。实验以三个独立系列重复进行并进行统计分析。计算漂白和绿色菌落的数量并估计其百分含量。根据下式计算氧氟沙星和AO诱导漂白度的的相对减少量作为所施用的CE壳聚糖的抗诱变能力（AP）的指标：

AP=(Bo-Bc) divide;Botimes;100％

其中AP是抗诱变效力（％），Bo是氧氟沙星或AO诱导的裸藻漂白度（％），Bc是氧氟沙星或AO诱导的和壳聚糖还原的眼虫漂白度（％）

抗氧化活性的测定 根据Re等人的研究结果，用一种改性的水溶性维生素E等价抗氧化能力(TEAC)的方法对CE-壳聚糖的抗氧化活性进行了评估［32］。脱色试验通过ABTS和过硫酸钾的反应，初步形成了蓝绿色ABTS 色团。添加抗氧化剂导致ABTS 自由基的减少，从而消除了颜色。这种效应取决于单个CE-壳聚糖的浓度和抗氧化活性，以及反应的持续时间。我们的试验中使用水溶性维生素E作为标准，并将测试化合物的抗氧化活性与水溶性维生素E的抗氧化活性进行比较。抗氧化活性定义为与1mu;mol的水溶性维生素E表现出相同的抗氧化能力的测试化合物的量（以mu;mol 计）。从结果中测定的氮含量计算出与样品质量相应的CE-壳聚糖的mu;mol 含量。

吸收光谱的测量 电子吸收光谱用柏楉4060分光光度计（瑞典乌普萨拉法玛西亚公司）上使用1.00-cm石英池进行。每个样品测量三次。CE-壳聚糖样品和AO相互作用的分光光度测量的细节在图5的图例中给出。

统计分析 所有计算值的统计数据由配对学生t检验（Pt）和方差分析（F检验）（PA）确定。 这些值表示F标准偏差（SD）。

结果

根据前面由Skorik等人描述的图1所示的方案［36］，已经实现了新型N-（2-羧乙基）壳聚糖的制备。使用不同比例的烷基化试剂（3-氯丙酸）作用于壳聚糖的氨基葡萄糖单体单元和不同的反应时间，制备了具有不同DS的三种N-羧乙基化衍生物（表1）。这些化合物已经用于下面描述的生物测试中，并且为了简单起见分别被称为样品1,2和3。就化学结构而言，样品1大约每第四个游离氨基被羧乙基取代，并且不包含双取代的残留；而在样品2的游离氨基中，单取代和双取代同时存在，平均大约一个取代基取代一个氨基（表1）；而在样品3中，DS=1.61反映了大约三分之二的初始游离氨基已经被双取代（表1）。

表1

CE-壳聚糖样品的反应条件和一些特性:

a T = 60℃，pH = 8-9（NaHCO3）。

b 3-氯丙酸/D-氨基葡萄糖残基摩尔比。

c 元素组成（质量含量，以％计）。

d 氮的摩尔含量。

e由1 H NMR谱确定的官能度的DF程度（官能团的比例）。

f 根据每份壳聚糖的D-氨基葡萄糖残基计算的DS，DS=（y 2z）divide;（x y z）。

g 表示乙酰化程度（DA）。

抗氧化活性 通过对ABTS 发色团产生的颜色淬灭程序的定量评价，对制备的CE-壳聚糖的抗氧化活性进行了评估。在这一实验中，三种壳聚糖样品的活性与参考抗氧化剂水溶性维生素E的活性进行了比较，它是alpha;-生育酚（维生素E）的衍生物并被用作标准抗氧化剂［2,8,24］。研究表明，所有制备的CE-壳聚糖样品都显示出高浓度依赖性抗氧化活性，其表示为表现相似抗氧化活性的水溶性维生素E相应的量。我们的结果没有显示出在测试化合物的抗氧化活性方面有显著差异（Pgt; 0.05）。 使用下式计算CE-壳聚糖样品的摩尔量（单体单元的微摩尔数）：

nu;(Glc-NR2 残留)= nu;(N)=m(样品) times;［N］

其中，nu;(Glc-NR2 残基)是CE-壳聚糖在mu;mol 中的单体单元的摩尔量，其等于氮的摩尔量m（N），因为每个单体单元仅含有一个氮原子，m（样品）是 以mg计的CE-壳聚糖的用量，并且[N]是通过元素分析建立的以mmol/g表示的CE-壳聚糖的氮摩尔含量（表1）。

因此，需要样品1的7.3mu;mol ，样品2的3.6mu;mol和样品3的2.9mu;mol 的量以显示与1mmol 水溶性维生素E相同的抗氧化活性。 图2显示CE-壳聚糖样品的抗氧化活性的线性浓度依赖性。

Y轴上水溶性维生素E的数量也用mu;mol 表示，以便比较更明显。因此，获得的结果表明制备的CE-壳聚糖比水溶性维生素E强100-300倍。

图2. 样品1(▲，虚线，y=(137plusmn;9)x，样品2(●,实线,y=(227plusmn;19)x,和样品3(■,短划线,y=(345plusmn;75)x中CE-壳聚糖的抗氧化活性对浓度依赖性（x），以水溶性维生素E的mu;mol表示。每个值均代表三次测量的平均值。

抗诱变活性 合成的CE-壳聚糖的抗诱变活性在实验中进行了试验，在涉及到遗传毒性剂AO和氧氟沙星对纤细裸藻的应用中，会导致了突变体(白色)菌落的形成。在对照板中，没有观察到白色菌落的发生。此外，在任何经过测试的浓度下，CE-壳聚糖样品1、2和3的应用并不会导致纤细裸藻突变菌落的形成。细胞存活率没有变化。

另一方面，诱变剂的应用导致突变发生。 浓度为15mu;g/ml的氧氟沙星诱导出48.2plusmn;3.2％的不可逆白色突变细胞，而浓度为5mu;g/ml的AO诱导了47.3plusmn;4.1％突变体。 通过计数与对照板相比受诱变剂影响的总菌落细胞数来估计纤细裸藻细胞的生存能力。 与负控制对照相比，氧氟沙星处理后裸藻细胞的活性没有变化，而AO处理后眼虫细胞的活性从100plusmn;11％降至80plusmn;19％（P lt;0.01）。

在样品2中氧氟沙星诱导漂白被最有效地抑制，样品2在10mu;g/ml浓度下将白色菌落的比例从48.2plusmn; 3.2 ％降低到28.6 plusmn; 1.8％，这代表在壳聚糖未处理的培养皿中初始突变发生率降低了40.8％。随着样品2的浓度逐渐增加（至50,100和200mu;g/ml），白色菌落的比例继续降低至23.5plusmn;1.5％，20.2plusmn;1.3％和15.5plusmn;1.2％（相对降低约51.3％，58.1％和67.9％）。类似地，浓度为10mu;g/ml的样品3中白色菌落的数量从48.2plusmn;3.2％降低至29.3plusmn;2.1％，并且在200mu;g/ml的浓度下，白色菌落的比例为16.6plusmn;1.3％ 。相应地，样品1在10mu;g/ml的浓度下将白色菌落的比例从48.2plusmn;3.2下降到31.2plusmn;2.5％，而在200mu;g/ml的浓度下，白色菌落的比例是17.9plusmn;1.5 ％，这意味着相对减少约35.4％和62.9％。与对照组相比，所有浓度的结果都具有高度统计学意义（t检验P<sub

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