超高温干旱胁迫对脯氨酸含量增加的转基因大豆多胺浓度的影响外文翻译资料

 2022-02-14 09:02

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超高温干旱胁迫对脯氨酸含量增加的转基因大豆多胺浓度的影响

Livia Simon-Sarkadia,*, Ga ́bor Kocsyb, A ́ gnes Va ́rhegyia, Ga ́bor Galibab, and Jacoba A. de Rondec

摘 要

在野生型和具有增加的脯氨酸水平的转基因大豆（Glycine max cv.Ibis）植物中比较超高温干旱胁迫对游离脯氨酸和多胺水平的影响。由于谷氨酸和精氨酸是脯氨酸和多胺的前体，因此认为脯氨酸水平的遗传操作也会影响多胺水平。在两种基因型处理后，脯氨酸和精胺酸浓度均有所增加，而腐胺浓度普遍下降或没有变化。干旱胁迫处理后，与野生型相比，在转基因植物中检测到更高的脯氨酸和更低的精胺水平，可能是由于转基因植物中脯氨酸合成的常用前体的使用增加所致。

关键词：多胺；脯氨酸；大豆

介绍

多胺（PA）对所有细胞都是必需的，因为缺乏合成多胺能力的突变体不能正常生长和发育（Galston和Kaur-Sawhney，1990）。作为聚阳离子，它们容易与细胞聚阴离子如DNA，RNA，磷脂和酸性蛋白质残基结合，影响它们的合成和活性。它们还参与生殖活动（花的萌生、果实的生长）（Galston等，1997）和植物的胁迫响（Bouchereau等，1999）。它们在轻度应力期间的积累起到一种硬化的作用，并在随后的胁迫处理下更好地存活。PA可以通过参与去除活性氧物质（ Guerrier 等， 2000 ）及参与维持膨体和光合作用活动（Galston等，1997）减少应激性损伤。多胺可以通过鸟氨酸脱羧酶和精氨酸（Arg）脱羧酶途径在植物中合成， 但后者在胁迫情况下更为重要（Tiburcio等，1997; Cohen，1998）。一些出版物报道了PA 参与干旱胁迫的反应（Erdei等，1996;Zhang等，1996;Rajasekaran 和Blake， 1999;Guerrier等，2000）。甘露醇诱导的渗透胁迫增加了小麦中腐胺（Put），亚精胺（Spd）和精胺（Spm）的含量（Galiba等，1993）。在一个时间过程实验中， 在干旱一周后检测到它们的水平大幅增加（Kubis和Krzywanski，1989）。类似地，渗透胁迫诱导耐受物种白花石竹中Put和Spd含量的增加要大于敏感品种的白花石竹。持水诱导耐旱甘蔗品种的Put合成(如Arg脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶活性的增加所示)显著高于敏感品种(Zhang等，1996)。通过对比芦苇生态型，进一步证明了多胺在干旱期间的适应性作用，因为陆生芦苇的Arg脱羧酶活性和PA水平高于沼泽芦苇生态型(Wang等，1995)。用S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶转化烟草导致多胺生物合成增加和耐旱性提高（Waie和Rajam，2003）。在干旱条件下，外源亚精胺和精胺刺激了伸长生长并减少了对松树幼苗的膜损伤（Rajase-karan和Blake，1999）不仅干旱，高温胁迫也会导致PAs的积累，正如对豆类的描述(Kuznetsov和Shevyakova, 1997)。高温胁迫诱导耐高温水稻基因型PA的合成和积累大于敏感型(Roy and Ghosh, 1996)。此外，外源Put可以缓解超最适温度下鹰嘴豆种子萌发的抑制作用(Gallardo等， 1996)。在水稻植株中也发现了多胺参与热应激反应，其中高温处理增加了尸碱、Put和Spd的含量(Shevyakova等，2001)。与PA类似，脯氨酸（Pro）在减少水分亏缺和高温造成的损害方面也起着重要作用（de Ronde等，2004；Georgieva等，2003）。它也起到抗氧化剂的作用（Hong 等，2000）。含有编码Pro生物合成的最后一种酶的基因的转基因大豆植物，在有义方向上具有1-Delta;1- 吡咯啉-5-羧酸还原酶（P5CR，EC1.5.2.2），具有更高的Pro含量并且遭受更少的同时缺水和热胁迫下的损害比野生型植物（de Ronde等，2004）。Pro和PA有两种常见的前体，精氨酸（Arg）和谷氨酸（Glu）（Cohen，1998）。因此假设Pro浓度的变化也导致PA合成的变化。

为了测试该假设，在过表达P5CR基因的野生型和转基因大豆植物中比较Pro和PA水平。

缩写：OPLC，超压层色谱;P5CR，1-Delta;1 - 吡咯啉-5-羧酸还原酶;PA（s），多胺;PC（A）：主成分

（分析）;PS，初步压力;Put，腐胺;RWC，相对含水量;Spd，亚精胺;Spm，精胺;Tym，酪胺。

材料和方法

植物材料和处理

野生型甘氨酸max（L.）。Merr研究了用含有热休克诱导型启动子的构建体转化的Ibis和转基因大豆植物以及在有义方向上编码P5CR的cDNA（de Ronde等，2004）。T3转基因植株的黄斑分析证实，在试验植物中存在3至5个拷贝的P5CR基因，并且在基因组中存在至少3个整合（de Ronde等，2004）。与野生型植株相比，P5CR mRNA水平为3至4倍，并且转化体中蛋白质水平高2至3倍。本研究中使用的两个品系是根据其耐旱性和Pro浓度选择的。将种子在两层湿纸之间在黑暗中在25℃下发芽4天。发芽后，将幼苗在含有2：1：1的花园土壤，腐殖质和沙子混合物的盆（一株植物/ 500mL花盆）中培养。将相同量的土壤（500g）置于每个花盆中，并在每次灌溉时加入相同量的水（200mL）。当花盆的重量比开始时减少200克时，对植株进行浇水。在干旱硬化和随后的胁迫开始时将它们的重量调整到该值。将植物在生长室（Conviron PGR-16 ，Controlled Env.Ltd。，Winnipeg，Canada）中在25/15℃日/夜温下生长6周，在400mu;molml-1下照射16小时（Tischner等，1997）。通过在35/25℃的日/夜温度下保持水10天对幼苗进行初步胁迫（PS）。然后将它们浇水一次并在35/25℃进一步培养，不再灌溉10天。干旱胁迫在较高的生长温度下进行，以便在引入的基因构建体中打开热诱导型启动子。在先前的工作中，干旱和热应激的组合在激活该启动子和操纵Pro水平方面是有效的（de Ronde等人，2004），因此在本研究中使用类似的实验系统。胁迫处理后的恢复处理是在25 /15℃下浇水10天。在实验开始时，10天PS后，4,7和10天胁迫处理后以及10天恢复后取样（最年轻的三叶完全发育的叶片）。伤害百分比也在这些采样点确定。根据嫩芽的萎蔫和干燥程度 ，将伤害百分比分为0到100％（Kocsy等，2005）。

相对含水量的测定

为了计算相对含水量（RWC），在取样后立即测量叶片的重量（直径8m）（初始重量，IW），在去离子水（膨胀重量，TW） 浸泡4小时后，随后在80℃下干燥24小时（干重， DW ）。 RWC 使用以下公式计算： 100*(IW－DW)/(TW－DW）（Kocsy等，2005）。

游离多胺的测定

使用振荡设备（VEB MLW，Labortechnik，Ilmenau ， Germany ） ，在室温下用3mL7％ HCIO4 萃取大豆样品（300mg）1小时。将每个样品通过0.45mu;m孔径的膜过滤器（Sartorius Gouml;ttingen，Germany）过滤。将样品提取物（500mu;L）与丹磺酰氯（18.5mu;mol ml-1的丙酮溶液;1000mu;L）混合，并加入饱和碳酸钠（500mu;L）。将混合物在室温下在黑暗中温育过夜。加入Pro（868.5mu;mol ml-1;200mu;L）并将混合物温水浴30分钟以除去过量的丹磺酰氯。丹磺酰胺用甲苯（500mu;L）萃取两次。

使用Personal OPLC在20times;20cm HPTLC（高性能薄层色谱）硅胶60F254 板（Merck，Germany）上色谱分析丹磺酰胺。BS50色谱仪（OPLC-NIT Ltd.，Budapest， Hungary）。参数如下：流动相：洗脱液A（第一步），正己烷/正丁醇/三乙胺90：10：8.1（v / v），洗脱液B（第二步），正己烷/正丁醇80:20（v / v）;德弗尔选择条件：外压，5.0 MPa流速，500mu;Lmin-1;快速体积，200mu;L;洗脱液体积A，11500mu;L，洗脱液体积B，800mu;L;开发时间，1576s。 使用 CAMAG SC3 （ CAMAG， Switzerland）密度计（Ko-vacs等，1998）在313nm处完成定量评估。

本研究中使用的所有化学品均为分析级。生物胺标准品：腐胺二盐酸盐，亚精胺三盐酸盐和精胺四盐酸盐购自Sigma（St.Louis，MO，USA）。标准溶液在0.1m盐酸中制备，并以与样品相同的方式进行丹酰化。

氨基酸的测定

从用于多胺的相同提取物（7％HClO4）中测定选定的氨基酸（脯氨酸及其前体精氨酸和谷氨酸）如前所述（Galiba等，1989）对氨基酸分析仪（Biotronik LC 3000，Germany）进行分析。

统计分析

分析一式三份进行，数据表示为平均值plusmn;SD。使用基于Windows的软件STATISTICA 6.0进行统计分析，包括主成分分析（PCA）和5％水平的治疗方法比较。

结果

在胁迫处理期间植物的损伤逐渐增加，并且在恢复期间略微减少（表I）。在PS期间，它在转基因植物中略低，并且这种差异在随后的胁迫和恢复的后半期变得显着。

表I 同时干旱和轻度热胁迫对野生型(W)和转化型(T)大豆植株伤害率的影响。在P＜0.05水平上，携带不同字母的值有显著差异。

图1.同时干旱和温和热胁迫对野生型和转化大豆植物的相对含水量（RWC）的影响。条形代表标准偏差。如果它们超过10.21％，则任何两个RWC值之间的差异在P lt;0.05水平上是显着的。PS，初步压力。

干旱胁迫对RWC的影响不大，与伤害一样明显。尽管转基因植物中的RWC略高于野生型植物，但在恢复期结束时仅在转基因大豆中观察到显着更高的RWC（图1）。表一同时干旱和轻度热胁迫对野生型(W)和转化型(T)大豆植株伤害率的影响。在P5%水平上，携带不同字母的值有显著差异。

该处理在转化体中诱导比在野生型植物中更快的Pro积累（表II）。PS后，Pro含量在野生型中增加了31倍，在转化植物中增加了124倍。在随后的胁迫期间，转基因植物中的Pro含量高于野生型。临床水平在恢复期间下降至起始水平。作为Pro前体的Glu和Arg浓度的变化是特别令人感兴趣的。一般干旱和热胁迫导致Glu含量增加，Arg含量降低。应激诱导的Glu增加远小于Pro。与Pro类似，在随后的压力期间Glu含量有所起伏随后在恢复期减少。Arg水平的降低在野生型中比在转化的植物中更明显。在野生型植物的PS末端和转化体中7天的胁迫后观察到总PA水平增加近3倍（数据未显示）。在其他采样点，此参数仅发现轻微变化。PS降低了Put水平，但在随后的压力的第一部分，Put内容再次增加（图2A）。随后在野生型植物中施加7天胁迫后和在转基因植物中施加10天胁迫后下降。在恢复期间，Put内容增加到起始值。主要的多胺是三胺Spd，其水平增加超过50％。

图2.同时干旱和温和热胁迫对野生型和转化大豆植物中腐胺（A），亚精胺（B）和精胺（C）含量的影响。如果它们分别超过0.09,2.02和0.27mu;mol g-1，则Put，Spd和Spm的任何两个值之间的差异在P lt;0.05水平上是显着的。PS，初步压力。

在野生型植物中的PS之后和在转基因植物中7天的胁迫之后（图2B）。在野生型植物中，Spd含量在胁迫期间逐渐降低，并且在10天后其水平比转基因植物低50％以上。在PS期间，毒鼠强Spm的含量显着增加。然后在短暂下降之后，水平再次增加，在恢复期间下降到起始值（图2C）。PS后两种基因型的精胺含量增加3倍。在野生型中10天胁迫后和在转化体中4和7天胁迫后Spm含量显着更高。关于Pro，PA及其前体，Glu和Arg的量之间可能的关系，主成分分析（PCA）显示两个主成分解释了数据总方差的70％（图3）。数据显示Put和Spm的含量与Put和Spd的含量之间存在显着的负相关，这可能是将Put转换为其他两个PA的结果。另一方面，表示Pro和Spm含量变化的点与该图中的Glu值非常接近，表明Pro或Spm合成的较大值导致了相应的增加前体Glu的水平。

表II。同时干旱和温和热胁迫对野生型（W）和转化（T）大豆植株脯氨酸，谷氨酸和精氨酸含量的影响。携带不同字母的值在P lt;0.05水平上显着不同。

图3. Arg，Glu，Pro，Put，Spd和Spm数据的主成分分析。未旋转的主成分载荷，PC1与PC2。

讨论

在对照条件下，转化不影响植物的生长，因为植物的损伤和RWC没有显着差异。如RWC数据和之前在小麦中报道的那样，PS处理有效地防止了后续胁迫期间的主要水分流失（Sgherri等，2000）。这反过来确保了保护性代谢途径的适当功能，如Pro和多胺合成增加所证明的。防止干旱引起的损害的效率得到了证实，即即使在野生型植物的情况下，伤害百分比也不超过32％。关于Pro对干旱和热胁迫的保护作用，本研究结果证实了以前的结果，其中耐受性小麦基因型在干旱期间与敏感小麦基因型相比

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