拟南芥RNA结合蛋白AtRGGA调节对水盐胁迫的耐受性外文翻译资料

 2022-02-14 09:02

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拟南芥RNA结合蛋白AtRGGA调节对水盐胁迫的耐受性

摘要：盐和干旱胁迫严重降低了全球植物生长和作物生产力。植物生物学研究的主题是鉴定应激反应和耐受的基因。通过微阵列分析，我们先前在马铃薯（Solanum tuberosum）StRGGA中鉴定了编码精氨酸甘氨酸甘氨酸（RGG）盒的RNA结合蛋白，其表达在逐渐暴露于渗透胁迫的马铃薯细胞培养物中特异性诱导。在这里，我们显示拟南芥直系同源物AtRGGA是一种功能性RNA结合蛋白，是对渗透胁迫的适当反应所必需的。在长期暴露于脱落酸（ABA）和聚乙二醇后，AtRGGA基因表达在幼苗中上调，而用NaCl处理导致AtRGGA下调。AtRGGA启动子分析显示在几种组织中的活性，包括气孔，控制蒸腾的器官。AtRGGA与黄色荧光蛋白的融合表明AtRGGA定位于细胞质和细胞质核周区域。此外，rgga敲除突变体在根生长和存活试验中对ABA过敏，在发芽期和营养期对盐胁迫过敏。AtRGGA过表达植物对板上和土壤中的ABA和盐胁迫表现出更高的耐受性，当暴露于干旱胁迫时积累较低水平的脯氨酸。最后，基因表达的全局分析揭示了盐胁迫下转录组的广泛改变，包括几种基因，如ASCORBATE PEROXIDASE2, GLUTATHIONE S-TRANSFERASE TAU9和一些SMALL AUXIN UPREGULATED样基因，在转基因和敲除植物中表现出相反的表达行为。

总之，我们的结果揭示了AtRGGA在植物响应和适应压力机制中的重要作用。盐度和干旱等非生物胁迫导致农作物产量大幅度降低。虽然盐胁迫具有由Na 毒性特异性引起的离子成分，但干旱和盐度都通过施加渗透胁迫来挑战植物，所述渗透胁迫由土壤水势降低引起。渗透胁迫的结果是，在植物中引发了旨在限制细胞损伤和挽救新的体内平衡的复杂反应，其包括生化和生理变化的协调，包括气孔关闭，细胞生长改变，光合作用抑制，开花时间和根构造。修饰和抑制种子萌发（Zhu，2002）。激素脱落酸（ABA）在调节这些过程中起关键作用。我们对渗透胁迫反应的理解取得了重大突破，最近鉴定出ABA吡嗪素抗性（PYR）/吡嗪素抗性1（PYR1）/调节因子-ABA受体（RCAR）受体的NENT及其在ABA介导的信号级联反应中的作用机制的阐明。

渗透胁迫诱导PYR/PYL/RCAR受体感知的ABA浓度增加。当连接ABA时，在PYR/PYL/RCAR受体家族的成员中诱导构象变化，其能够结合并抑制2C型蛋白磷酸酶，从而释放SUCROSE非发酵相关蛋白激酶-2。2（SnRK2。2），SnRK2。3和抑制性的SnRK2。6激酶。反过来，ABA激活的SnRK2s磷酸化ABA反应元件结合转录因子如ABF2诱导ABA反应基因的上调，并且在保卫细胞中，定位于质膜的离子通道如SLOW ANION CHANNEL1和POTASSIUM CHANNEL IN ARABIDOPSIS THALIANA1 钾通道促进和维持气孔关闭。不依赖ABA的途径，其可能涉及SnRK2家族的ABA无应答成员，也参与渗透胁迫应答并且似乎与ABA介导的途径相互作用和收敛。

虽然在阐明感知和信号级联导致基因表达和通道激活的应激诱导修饰方面取得了显着进展，但RNA调控机制如RNA分子的合成，加工，转运，翻译，储存，稳定性和降解等都是作为参与调节细胞应激反应的关键过程而出现。在对盐胁迫耐受所需的Na /H 反向转运蛋白盐过量敏感性1（SOS1）的情况下，已知mRNA稳定性机制的重要性。SOS1 mRNA在对照条件下高度不稳定，但在施加盐胁迫后10分钟内，SOS1转录物在由活性氧物质介导的过程中稳定。在缺氧的情况下，压力对翻译效率的强烈影响已经显示出来，其中Branco-Price等人。（2008）证明了选择性mRNA翻译机制而不减少转录协调代谢调节氧缺乏。最近，显示RNA结合蛋白（RBP）OLIGOURIDYLATE BINDING PROTEIN1通过在应激颗粒中。

螯合mRNA而参与缺氧期间的选择性mRNA翻译机制。在再氧合时，应力颗粒溶解并且mRNA返回到主动翻译多核糖体。RNA代谢的直接或间接调节涉及RBP，其基于几种不同功能基序和结构域的存在和组织而区分，RNA识别基序（RRM）和K同源结构域是植物中最常见的其他结构域和基序包括Tudor SN结构域，Arg重复序列，富含甘氨酸结构域（GR），锌指结构域，Arg/Gly基序，以及冷休克域。最近已经证明几种RBP参与植物发育和应激反应。Tudor SN蛋白是参与盐胁迫下RNA稳定性控制的RBP。双突变体tsn1/tsn2显示在高盐度胁迫下萌发，生长，存活和适应性急剧降低。还显示RBP参与对热和冷应激的反应。C-REPEAT/DEHYDRATION调节剂-响应元件结合因子基因EXPRESSION3是含有K同源结构域的RBP，通过抑制几种热应激因子（如HSFA1a，HSFA1b和HSFA1d）的表达，显示它是热应激反应的负调节因子。富含甘氨酸的富含甘氨酸的RBP AtRZ-1A由冷诱导，并且当过表达时，增加拟南芥的抗冻性。操纵含有GR- 和RRM结构域的蛋白质AtGRP7的表达会影响高盐度，干旱或低温胁迫下的胁迫耐受性。过表达AtGRP7会增加冰冻耐受性，但也会导致盐胁迫或脱水胁迫下的萌发和幼苗生长延迟。

为了鉴定对渗透胁迫适应性重要的基因，我们分离了编码推定的RBP 的基因StRGGA，其表达在马铃薯细胞培养物中诱导，逐渐适应高浓度的聚乙二醇（PEG），而没有当用PEG冲击细胞时观察到StRGGA表达的变化在这里，我们提出拟南芥中推定的RGGA直向同源物的特征。AtRGGA在几种组织中表达，包括气孔，并且在暴露于PEG 和ABA 的细胞和植物中转录本丰度增加。AtRGGA编码能够在体外结合RNA的胞质蛋白。过量表达AtRGGA的转基因植物对ABA，干旱和盐胁迫更耐受，而rgga突变植物对ABA和渗透胁迫更敏感。操纵AtRGGA表达对全基因表达具有严重影响，表明AtRGGA在植物中具有重要的功能作用。

结果

AtRGGA基因表达对应激和ABA处理的响应

在先前的研究中，我们分离了StRGGA（GenBank登录号FM209282），其基因表达在马铃薯的培养细胞中特异性诱导，逐渐适应高浓度的PEG。马铃薯细胞暴露于突然的渗透胁迫并未引起StRGGA 转录本丰度的变化

（Ambrosone等，2011;图1A;补充表 S1)。推断的StRGGA 蛋白质序列与拟南芥At4g16830位点编码的蛋白质具有63％ 的序列同源性（补充图S1），因此，假设是拟南芥直系同源物（AtRGGA）。为了研究拟南芥中是否也通过胁迫 处理诱导AtRGGA，我们分析了暴露于NaCl和渗透（PEG） 胁迫的细胞和幼苗中的基因表达。还包括ABA治疗以评 估激素可能参与AtRGGA转录物丰度的调节。在MM2D细胞 中（Menges和Murray，2002），与对照未处理的细胞相 比，NaCl，ABA和PEG处理诱导AtRGGA的显着上调（图1B）。

图1.RGGA在马铃薯和拟南芥中的表达分析。A，在对照条件下和在逐渐（PEG适应的）或突然（PEG-震动的）暴露于PEG后马铃薯的细胞中RGGA的表达。B，在拟南芥MM2D细胞中暴露24小时至NaCl（150mm），ABA（50mM）或10％（w/v）PEG的RGGA的基因表达。C,Atrga如图所示，在14天龄的拟南芥幼苗中表达，用不同浓度的NaCl处理24小时。D，暴露于35％（w/v）PEG，NaCl（120mm）或ABA（10mM）48小时后拟南芥幼苗中的AtRGGA表达。通过定量逆转录（qRT）-PCR进行基因表达分析。NaCl处理后诱导似乎最高，然而，这也导致细胞活力降低（补充图S2)。在幼苗中，使用不同浓度NaCl的24小时处理导致AtRGGA表达的轻微下调（图1C），而暴露于ABA和PEG2天的幼苗中有上调（图1D），表明AtRGGA转录本丰度在短期内受盐胁迫的影响，但在较长时间暴露于ABA和渗透胁迫时增加。

AtRGGA体外结合RNA

AtRGGA的蛋白质序列分析显示在酵母（酿酒酵母）Stm1核酸结合蛋白的N-末端区域发现了Tom1（Stm1）结构域的抑制因子，以及透明质酸结合蛋白和HABP4_PAI-RBP1结构域，在RBP中发现，表明AtRGGA可能是RBP（图2A）。为了验证该假设，使用重组的His标记的AtRGGA（His-RGGA）和从对照提取的总RNA以及盐胁迫的完整幼苗进行RNA电动转移测定（EMSA）。在天然条件下电泳之前，用生物素标记RNA并与或不与His-RGGA一起温育。使用重组形式的PYR1ABA受体His-PYR1作为阴性对照。如图2B所示，当RNA与AtRGGA孵育时，特异性地观察到RNA迁移率变化，表明AtRGGA能够结合RNA，并且通过添加过量的未标记RNA来竞争结合，从而表明AtRGGA是真正的。RBP。为了评估AtRGGA与RNA结合的特异性，将poly（A ）和poly（A2）RNA级分用于RNAEMSA。孵化后的带移当使用poly（A2）RNA时观察到His-RGGA，表明RGGA结合聚（A2）RNA部分中包含的一种或多种RNA。

AtRGGA组织和蛋白质亚细胞定位中的启动子活性

为了深入了解AtRGGA在植物中的功能，我们继续分析其表达模式和亚细胞定位。表达由AtRGGA推定的启动子（定义为蛋白质编码序列上游2kb）驱动的GUS报告基因的转基因植物用5-溴-4-氯-3-吲哚基葡糖苷酸染色，以显现其空间和时间模式。AtRGGA启动子的活性。如图3所示，GUS活性在幼苗和成年植物中在几个器官中可见，包括叶，根，花序和长角果。有趣的是，在叶子内，观察到强烈的气孔染色（图3D），表明AtRGGA在保卫细胞中的表达。在生殖器官中，GUS活性在花粉粒（图3，G和H）和发芽花粉管（图3H）以及将种子附着到长角果（图3，M和N）中可见。通过GUS染色测定收集的结果通常与公开可获得的表达数据一致，所述表达数据显示在所有分析的组织中存在AtRGGA转录物。（补充图s3）为了分析AtRGGA蛋白亚细胞定位，我们产生了过表达黄色荧光蛋白（YFP）-RGGA融合蛋白的转基因植物。在碘化丙啶中短暂孵育以复染细胞壁后，通过共聚焦激光扫描显微镜观察YFP-RGGA的幼苗。如图4A所示，在根尖的细胞中，空泡较不发达，在细胞质中观察到清晰的YFP信号。

图2.A，拟南芥AtRGGA蛋白结构域组织的示意图。灰色框表示Stm1N末端结构域（Stm1;InterPro编号IPR019084）和透明质酸/mRNA结合结构域（HABP4_PAI1_RBP1;InterPro编号IPR006861）的位置。B，用重组AtRGGA（His-RGGA）孵育的拟南芥RNA的EMSA。从NaCl处理的（盐胁迫RNA）或未处理的（对照RNA）植物中提取RNA并用生物素标记。未标记的RNA（160倍）用作竞争剂。重组PYR1（His-PYR1）用作阴性对照。C，拟南芥总EMSA，poly（A ）和poly（A2）RNA，不含或不含重组AtRGGA（His-RGGA）。括号表示标记的RNA，箭头表示RGGA结合的RNA。

在碘化丙锭溶液中长时间孵育后，可以实现核DNA的轻微染色。在这种情况下，我们观察到YFP-RGGA从根伸长区的细胞核中排除，而强YFP荧光在细胞质的核周区域中可见（图4B）。在叶组织中，YFP信号在气孔中特别强（图4C）。使用表达AtRGGA与YFP的C末端融合的转基因植物获得了类似的结果（图4D）。总之，蛋白质亚细胞定位研究表明AtRGGA定位于细胞质和核周区域。

AtRGGA的功能分析

为了表征AtRGGA在植物对盐和干旱胁迫的响应中的作用，转移DNA（T-DNA）插入突变体，其中AtRGGA基因表达被废除（SALK_143514;rgga;图5A;补充图S4）获自拟南芥生物资源中心，以及过量表达FLAG-RGGA融合蛋白的转基因植物（图5B;补充图S4)生成了。在对照条件下，与野生型Columbia-0（Col-0）植物相比，rgga植物似乎具有更大的玫瑰花结，并且在长日照（光照16小时/黑暗8小时）中显示延迟开花。（补充图S4)。存在应激时的表型分析在不同的发育阶段进行。在萌发阶段，与野生型Col-0相比，rgga对NaCl的敏感性更高。特别地，虽然在暴露于NaCl（120mm）7天后平均83％的Col-0种子呈现完全扩展的子叶，但只有64％的rgga种子发芽（图5C）。相比之下，过度表达植物的种子（35S::FLAG-RGGA）在盐胁迫培养基中的发芽能力与野生型或用空载体转化的对照组相比没有任何显著差异（图5C）。

图3.拟南芥组织中的AtRGGA启动子活性。在AtRGGA启动子控制下表达GUS报告基因的转基因拟南芥植物的营养和生殖组织中进行GUS染色。将5日龄幼苗(A)，根(B)，叶(C)，花序(E)和长角果(L-N)染色。气孔(D)，花药(F)，柱头(G)，卵巢(H)和胚珠的特写视图(I)也显示出来

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