氧化苦参碱混合胶束纳米粒的制备及体外抗肿瘤活性研究外文翻译资料

 2022-05-30 10:05

氧化苦参碱混合胶束纳米粒的制备及体外抗肿瘤活性研究

Nan Jin, Yong-Xing Zhao, Shu-Hua Deng, Qian Sun

摘要：

本研究的目的是制备氧化苦参碱（OMT）混合胶束纳米粒子以延缓药物的释放并增强其对癌细胞的细胞毒性。 选择脂质E80，类脂S75，MPEG-PLA和泊洛沙姆188共溶剂蒸发法制备OMT制剂，评价其释放特性，体外细胞毒活性和物理特性。 结果表明，OMT混合胶束纳米粒在体外对SMMC-7721细胞具有缓释和细胞毒活性

  1. 介绍

氧化苦参碱（Oxymatrine，OMT）是一种从狐尾草属苦草或黄色苦参根中提取的喹诺酮生物碱（Zhou et al.2010），在中国广泛用于治疗病毒性肝炎（Zheng et al.2009）。近年来的进一步研究表明，OMT也具有抗肿瘤特性（Song et al.2005; Zhou et al.2010）。然而，由于OMT的亲水性，其穿透肠上皮细胞及其在大鼠胃肠道中的吸收非常差（Yue et al.2010）。此外，有一个假设，即口服OMT可能会导致更多的副作用，并且在肝病患者中效果不佳（Liu 2007）。在那种情况下，肠胃外制剂会更好。不幸的是，OMT注射的消除半衰期比预期的要短（Wang et al.2003），因此我们的目标是制备具有延迟药物释放和增强对癌细胞的细胞毒性的能力的新型注射制剂。

据报道（Hu 2009），OMT的油/水分配系数为0.2，表明OMT在脂质体中不容易加载，并且使用标准方法的脂质体的包封率不超过20％。纳米技术（Zheng et al。2010）是解决药物输送系统某些问题的有前途的方法。装载有低分子量药物的纳米药物载体的尺寸通常在50-300nm范围内（Olivier 2005）具有增强渗透性和滞留（EPR）效应的能力，导致在肿瘤部位的较高药物浓度， 毒性降低和药物释放控制（Nishiyama和Kataoka 2006; Oerlemans等2010）。鉴于所获得的有利特性，Micelles（Rapoport 2007）总是用于疏水性药物：溶解低溶解度药物，具有肿瘤靶向潜力和控制药物释放。 已经使用胶束递送部分可溶的DNA（Vachutinsky等2011） 也就是说胶束具有用于亲水性药物的潜力。混合胶束（Torchilin2001; Mu等人，2010）与胶束相比具有一些优点，例如高生物利用度，跨生理学障碍的高渗透性和静脉内给药后的长血半衰期。另外，包含MPEG-PLA（MPP）和Pluronic共聚物的混合胶束（Vachutinsky等2011）已经开发用于增强生物利用度并克服癌症治疗中多西他赛的多药物抗性。因此，制备了使用MPP和Pluronic共聚物（F68 / Poloxmaer188）和其他赋形剂的OMT混合胶束纳米粒子（OMT-Mmnps）。

  1. 调查和结果

2.1色谱特异性

通过比较空白Mmnps和OMT Mmnps与相同赋形剂的HPLC色谱图，研究色谱条件的特异性。色谱图在图1（a，b，c）中以特定的色谱条件再现。使用C18柱将OMT从Mmnps中分离出来。没有与OMT共洗脱的干扰峰（图1c）。 结果显示制剂中的材料不干扰OMT峰。保留时间为7.19分钟。

2.2校准曲线

通过对OMT样品的峰面积（A）与加标浓度（C）进行线性回归分析来构建校准曲线。 结果发现，在2.5〜100.0mu;g·mL-1浓度范围内，OMT检测器响应呈线性，相关系数为0.9999。 OMT在甲醇中的校准曲线是A = 11.422C-0.519。 定量下限（LLOQ）为2.5mu;g·mL-1。该HPLC方法的日内和日间方差以及OMT的回收率均在可接受的范围内。

图一 标准溶液（a），空白Mnps样品溶液（b）和OMT-Mnps样品溶液（c）的HPLC色谱图

2.3 OMT-Mmnps的制备

如图2（a，b，c）所示，通过比较包封效率（EE），最初尝试不同比率的材料以找到合适的制剂。选择具有相对较高EE值的制剂以测试它们在0.5小时时的体外释放，结果示于图3中。结果表明ap6在0.5小时释放最低，因此制剂ap6是进一步研究的焦点

图二 MPEG2000-PLA3000（a），泊洛沙姆188（b）和类脂S75（c）的各种重量比对OMT-Mmnps的EE的影响

2.4 OMT-Mmnps的特性

ap6的组分是OMT /类脂S75 / MPEG2000-PLA3000 /泊洛沙姆188（w / w / w / w）：3/6/6/3，而在ap8中，相同量的MPEG2000-PLA16000代替MPEG2000-PLA3000。ap6和ap9之间的差异不是材料，而是序列：首先将泊洛沙姆188与OMT和类脂S75组合，而不是稍后单独加入水中。ap6，ap8和ap9的物理特性如图4（a，b）所示。

图三 OMT-Mmnps的累积药物释放和EE

图四 ap6，ap8和ap9（a）的EE和z-ave; ap6，ap8和ap6的PDI和ZP

ap9（b）

结果表明ap6将是关于EE，z-ave，PDI和ZP的最佳制剂，这意味着该制剂可能易于被网状内皮系统（RES）吞噬（He和Li 2010）并因此积累在 由于它的z平均值小于200nm，所以肝脏的尺寸分布如图5所示.Am6的平均粒径为128.8plusmn;5.3nm，PDI为0.251plusmn;0.008，表明它的单分散性和水中稳定性。

图五 Mmnps的表征

2.5 OMT-Mmnps的释放率分析

通过绘制释放药物的百分比与Mmnps中包封的OMT量的关系（图6），获得OMT-Mmnps的体外释放曲线。为了确定MPEG2000-PLA30000在存在相当大的游离药物的情况下对混合胶束的药物释放特性的影响，我们制备了ap8，其中MPEG2000-PLA30000被MPEG2000-PLA16000和ap10代替，其仅与MPEG2000-PLA30000相比较AP6。如上所述，Ap9使用与ap6不同的序列制备。

图6表明ap6表现出低爆裂效应，在开始的0.5小时内释放41.12％的药物，并且12小时后OMT释放曲线显示持续释放阶段。36小时内释放的药物累积量为100％。与ap10（p lt;0.05）和OMT溶液（p lt;0.05）相比，由于添加了MPEG2000-PLA30000，明显的是ap6的药物释放速率显着降低，特别是在前几个小时。但是，ap8（使用MPEG2000-PLA16000）比OMT水溶液略好（pgt; 0.05）。在12小时之前，药物从ap6释放得比ap9快一点，然后他们几乎以相同的方式释放。Ap9也优于OMT水溶液（p lt;0.05）。然而，鉴于EE，z-ave和PDI，ap6是未来研究的首选。

图6 Mmnps和OMT解决方案中OMT的释放曲线

2.6 ap6的体外细胞毒性

进行细胞抑制测定以评估OMT-Mmnps和OMT溶液的抗癌活性。 结果显示，OMT-Mmnps对癌细胞的细胞毒性大于OMT溶液。结果显示，OMT-Mmnps对癌细胞的细胞毒性高于OMT溶液。

图7 ap6和OMT溶液的生长抑制

3.讨论

如图2（a，b，c）所示，尽管与MPEG2000-PLA30000中的变化没有明确的相关性，但结果表明泊洛沙姆188和类脂S75对提高OMT负载有重要影响。对于泊洛沙姆188，这可能是其溶解能力低的结果（Zheng 2000; Agrawal et al.2006）：泊洛沙姆188的聚氧丙烯嵌段作为疏水基团形成核心，然后，由于存在许多醚氧原子在那里，核心是比较亲水的。对于类脂S75，它可能是胶束两亲状结构的结果。类脂S75的疏水端可以插入核中，并且由于其相对于MPP的链相对较短，其一部分OMT所连接的亲水端被迫进入核。

图6中的结果表明，当ap10与ap6对比时，OMT和MPP之间可能存在强烈的相互作用。进一步考虑ap6和ap8之间的行为差异表明，在这些小规模实验中，疏水链（PLA）越重，相互作用越强。这可能是因为疏水链长度越长，核心半径越大，OMT需要更多时间才能通过核心扩散。在最初的几个小时里它的快速释放倾向于支持这种说法：当脂质S75的短亲水性末端与疏水性末端相连时，OMT被迫进入核心。

在那种情况下，首先吸收在核心表面上的OMT迅速释放。此外，根据一篇参考文献（Agrawal et al.2006）的理论，Mmnps释放速率在4小时后相对较慢，该理论认为药物首先发生聚合物-药物相互作用，然后扩散出聚合物基质。OMT测定的细胞毒性测定表明，OMT溶液和OMT-Mmnps对SMMC-7721细胞都具有细胞毒性，并且OMT-Mmnps对癌细胞的细胞毒性大于OMT溶液。

Jones等人（2008）表明，本研究中使用的材料安全，生物相容性和商业可用-总是用于疏水性药物。据我们所知，它们在这里一起使用时没有报道过使用亲水性药物来延缓药物释放，从而增加肝癌部位的积聚并增加它们的细胞毒性作用。此外，该方法在短时间和低成本下易于应用。最后但并非最不重要的是，该制剂具有亲水性生物大分子的潜力。

4.试验

4.1化学品和试剂

OMT（纯度gt; 98.8％）购自Aroma Chemical Co.，Ltd（中国杭州）。HPLC级甲醇和乙腈由Siyou Chemical Reagent Co.，Ltd（Tianjin，China）提供。 Lipoid S75是Lipoid GmbH（Ludwigshafen，Germany）的产品。聚乙二醇甲氧基聚（d，l-乳酸），MPEG-PLA，由Daigang Co.，Ltd（Jinan，China）合成。泊洛沙姆188得自BASF（德国）。 SMMC-7721细胞系由河南省医学研究所（郑州，中国）捐赠。所有其他试剂均来自各种供应商的分析级。

4.2 OMT-Mmnps的制备和表征

共溶剂蒸发法用于MPP /泊洛沙姆188的自组装，加入类脂S75以增强OMT的疏水性。在包封率（EE），粒径（z-ave），多分散性指数（PDI）方面改变共溶剂蒸发中四种物质（OMT，Lipoid S75，MPP和泊洛沙姆188）和zeta;电位（ZP）。将OMT和不同比例的类脂S75溶解在圆底烧瓶中的无水乙醇中。在真空下除去醇，导致形成均匀的膜。将药物 - 聚合物膜在不同量的MPP中水合，将其溶于丙酮和无水乙醇中，在磁力搅拌下将所得混合物逐滴加入到各种量的泊洛沙姆188的水溶液中。完成10分钟混合后，施加真空以除去剩余的有机溶剂。获得具有淡蓝色乳光的OMT-Mmnps作为最终产品。空白Mmnps也以相同的方式准备。使用Malvern Zetasizer Nano-ZS90（Malvern Instruments，UK）测量z-ave，PDI和ZP。

4.3 HPLC测定

4.3.1 色谱设备和条件

装载在胶束中的OMT的含量通过反相HPLC定量，使用具有自动取样器的Agilent1200泵，Agilent UV阵列检测器和Agilent C18柱（5mu;m，内径4.6mmtimes;150mm），Agilent Zorbax SB-C18 警卫队。 等度流动相包含92.5％乙酸铵（0.01M，pH7.0）（v / v）和7.5％乙腈，流速为1.0mL/min。 OMT的检测波长为220nm。使用20℃的注射量在30℃测定OMT浓度。

4.3.2 制备OMT原液和标准溶液

OMT的标准储备溶液在甲醇中的浓度为2.5 mg·mL-1，储存在-4℃直至分析。 原液用甲醇稀释至终浓度为2.5,5.0,12.5,25.0,50.0,75.0和100.0mu;g·mL-1。 将该溶液在环境温度下平衡30分钟，并在制备当天用于构建校准曲线。

4.4 包封率

按照文献中的方法（Wang等，2003），用甲醇稀释胶束样品以破坏自组装结构，并将其注入HPLC系统以确定最初添加的OMT的重量。以相同的方式测量通过离心和超滤处理的胶束样品的相同体积的滤液以找到胶束中OMT的重量。包封率由下式计算：

4.5 体外释放研究

使用优化的制剂制备载药胶束。然后，将1mL胶束制剂加入到小型透析试剂盒（分子量截留8000〜14,000Da）中，将其置于含有50mL作为释放介质的磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH7.4）的烧杯中。系统保持在37.0plusmn;0.5◦C，搅拌速度为100 rpm。在0.25小时，0.5小时，1小时，2小时，4小时，6小时，8小时，12小时和36小时从试剂盒中取出0.2mL样品，用相同体积的新鲜PBS代替。如上所述通过HPLC定量释放的药物，绘制随时间推移的累积释放曲线。

4.6 细胞培养和孵育条件

SMMC-7721细胞是人肝细胞癌细胞。在37°C的湿润气氛（5％CO2加95％空气）下，它们在我们实验室的连续培养基中保持在改良的RPMI 1640（Roswell Park Memorial Institute培养基1640）中。对于实验，在用胰蛋白酶消化后，将SMMC-7721细胞以5x10 3个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并用补充有10％胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基稀释。治疗前24小时，将它们在补充有10％FBS的RPMI 1640中培养，然后从培养基中取出，并用不同浓度的待测物质处理。将它们在37℃，5％ CO 2下孵育4小时，然后在培养基（补充有10％FBS的RPMI 1640）中再置换24小时。对照培养基为OMT水溶液，培养于对照培养基中的SMMC-7721细胞为对照细胞作为参考

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