聚乙二醇修饰的聚（d,l-丙交酯-共-乙交酯）白藜芦醇纳米颗粒表征及其抗活性外文翻译资料

 2022-05-30 10:05

聚乙二醇修饰的聚（d,l-丙交酯-共-乙交酯）白藜芦醇纳米颗粒表征及其抗活性

作者姓名：李晶，赵丽华，黄新，刘磊，张正政，陈玉祥，蔡平人.

1 中南大学湘雅医院肝胆肠外科研究中心，长沙410008

2 广西中医药大学附属瑞康医院整形美容中心，南宁530011

3 癌症研究所，癌症医学协同创新中心，中国癌症研究重点实验室

中国卫生部中南大学基础医学院，长沙410078

摘要：

为了制备载有白藜芦醇的PEG-PLGA纳米粒子（即白藜芦醇包裹在PEG-PLGA-NPs中）和测试他们的抗癌作用。载有白藜芦醇的PEG-PLGA纳米粒通过双重乳液制备溶剂蒸发法制备，并在HepG2肝脏癌细胞中测试纳米粒子的抗癌作用。 载有白藜芦醇的PEG-PLGA纳米粒的平均粒径135.9nm，窄直径分布，包封率为68.2％，载药量为8.34％。体外释放实验显示从PEG-PLGA纳米粒释放出白藜芦醇需要持续释放超过13天，这符合Higuchi方程。PEG-PLGA纳米粒通过时间和剂量方式抑制肝癌细胞生长。载有白藜芦醇的PEG-PLGA白藜芦醇是一种潜在的缓控释纳米药物，具有抑制肿瘤细胞在肝癌细胞中的生长的作用。

关键词：PEG-PLGA，白藜芦醇，双重乳化溶剂挥发法，体外研究，药物释放，生物活动

一：介绍

白藜芦醇（RES）（3，5，4-三羟基反式二苯乙烯）是一种一类天然苯酚和植物抗毒素的类二苯乙烯类化合物，天然的白藜芦醇主要来源于这些植物包括红葡萄皮和其他水果以及日本虎杖的根。目前正在进行许多关于白藜芦醇的药理作用的研究在大量动物体和人体上。例如，在用致癌物处理过的小鼠中，外用白藜芦醇第一次被发现可以阻止皮肤癌的发展。RES(1毫克/千克口服)可以减少用致癌物处理的大鼠食管肿瘤的数目和大小。小剂量（0.02～8毫克/千克）白藜芦醇可以预防性地减少或阻止在给予不同的致癌剂的大鼠的肠壁和结肠肿瘤的发展。同样的外用RES在使用UVB照射前后都有抑制皮肤损伤和降低皮肤癌的发病率的作用。小鼠腹腔注射2.5或10毫克/千克的白藜芦醇可以减慢小鼠转移性Lewis肺癌的生长。相反，口服白藜芦醇在治疗黑素瘤肿瘤异种移植中无效。白藜芦醇口服给药对白血病或肺癌也没有作用，对白藜芦醇在人体中的药效学研究显示即使是高剂量的白藜芦醇也可能不足以实现减少白藜芦醇系统防御癌症需要的时间。动物癌症模型的研究也揭示了白藜芦醇的体内有效性受限于其系统的生物利用度。

近年来，在药物输送方面，生物可降解聚合物纳米颗粒表现出具有重要意义的治疗潜力。可生物降解聚合物及其共聚物用PEG闭塞或多次阻塞已被普遍的使用来形成核壳结构的纳米粒用于封装各种治疗化合物。这些纳米粒有许多吸引人的特点：它们的疏水核心能够携带高度不溶性药物具有较高的承载能力，同时其亲水性壳为表面改性提供立体保护和功能基团。由聚乙二醇改性的聚（d,l-丙交酯-共-乙交酯）PEG-PLGA（PEG-PLGA）可生物降解的聚合物NPs已被广泛作为药物输送系统使用。由PEG-PLGA制备的纳米粒正在被广泛的研究由于它们的特性，例如控制释放，长-循环时间、生物降解性、生物相容性和被动靶向性。有几种关于可生物降解聚合物纳米颗粒的制备的方法已经被报道，例如溶剂蒸发，纳米粒沉淀和盐析。在这些方法中，双重乳液溶剂蒸发法是用于药物包封最常用的方法。

在这项研究中，我们通过PEG-PLGA制备了负载白藜芦醇的纳米粒来提高白藜芦醇的系统可用性以提升在抗肿瘤治疗中的潜在应用。

二：材料和方法

2.1 PEG-PLGA纳米粒的制备

通过双重乳化溶剂蒸发（W1 / O / W2）方法制备负载有白藜芦醇的PEG-PLGA纳米颗粒。简单地，一定量的的白藜芦醇溶液被用作为内部的水相（10毫克/毫升，白藜芦醇溶解于乙醇中）加入到一定量用丙酮溶解的PEG-PLGA的有机相中。然后，将混合液进行超声形成主要为W1/O乳液的形态，将该乳液转移到含有作为外水相的乳化剂的水溶液中以形成W1 / O / W2乳液，在室温下在通风橱中轻轻搅拌W1 / O / W2乳液，直到有机物溶剂蒸发完全，制备的纳米粒子是在4℃温度下离心（16,000rpm /分钟）一个小时，离心完成后用蒸馏水洗涤三次以除去乳化剂，得到的纳米颗粒悬浮液冻干并保存在干燥器中。

2.2 鉴定PEG-PLGA纳米粒子

将每种纳米颗粒制剂用蒸馏水稀释至适中浓度，并通过Zetasizer 1000HS测定颗粒大小。 为了测定包封率和载药量，首先将获得的纳米颗粒悬浮液在4℃下离心（16,000rpm / 分钟）1h，使用297nm的UV检测上清液以确定药物浓度。 药物包封率= 1-Cf / Ct）times;100％[Cf：游离药物含量，Ct：复合物中药物总含量]。 药物负载量= [复合物中的药物含量/（复合物中的药物含量 纳米载体含量）]times;100％。

2.3 体外释放

将分散在5mL的PBS（pH = 7.4）中的50mg的负载有白藜芦醇的PEG-PLGA纳米粒封入透析袋，并在温度为37℃，体积为500mL的PBS（pH 7.4）溶液中搅拌，搅拌速度为120转/分钟。在预定好的时间间隔内，取出5mL样品，在4℃下离心（16000rpm / min）一个小时后，测定上清液。该取出的5ml的样品体积立即用5mL PBS（pH 7.4）代替。时间间隔分别为0.25，0.5，1和2小时，并且每天一次，直到透析袋中的内容物完全释放，在垂直轴上绘制累积释放百分率，并在水平轴上绘制时间，从而得到药物释放曲线。

2.4 细胞培养

将HepG2肝癌细胞放在含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中并且置于37℃，5％CO2和饱和湿度条件下培养。处于对数生长期的细胞用于实验。

2.5 MTT分析

将HepG2细胞悬浮于RPMI-1640培养基中，并以每孔104个细胞种于96孔板中。 将白藜芦醇和PEG-PLGA-RES纳米粒以0.5，2.5，5，10和50mg / mL的浓度溶解在培养基中（以白藜芦醇内容计算）。 PEG-PLGA空白纳米颗粒（PEG-PLGA的量等同于含有白藜芦醇 50.0mg / LPEG-PLGA-RES纳米粒中的PEG-PLGA的量）溶解在培养基中。

细胞分成四组：

（1）对照组。

（2）阴性对照组：不含有RES的PEG-PLGA纳米粒。

(3) 阳性对照组（白藜芦醇）：不同浓度的白藜芦醇溶液。

(4) 实验组（纳米粒）：不同浓度的PEG-PLGA-RES-纳米颗粒。

处理24，48，72,和120小时后，向96孔板的每个孔中加入20mu;LMTT（5mg / mL），并将细胞孵育4小时。然后轻轻吸出培养基后，每孔加入150mu;LDMSO，然后轻轻摇动孔10分钟，将紫色晶体溶解。 通过酶标仪在490nm处测量吸光度（OD）值。 细胞增殖计算如下：

抑制率（％）=（药物处理组的1-OD /对照组的OD值）times;100％。

使用对数概率方法测定IC 50以使用线性回归方程计算抑制50％肿瘤细胞生长所需的药物浓度。

2.6 统计分析

数据表示为平均值plusmn;标准偏差（Xplusmn;SD）。使用Windows 8的SPSS进行统计分析。 统计上认为p值lt;0.05是有重要意义的。

表一PEG-PLGA对HepG2细胞的抑制作用（n＝4，Xplusmn;SD）；

OD值 细胞毒性组

时间（天） 控制 负控制 P 抑制率（%） 存活率（%）

1 0.5038plusmn;0.0085 0.4680plusmn;0.0196 gt;0.05 7.1 92.9

2 0.5495plusmn;0.0219 0.4800plusmn;0.0320 gt;0.05 12.6 87.4

3 05788plusmn;0.0131 0.5173plusmn;0.0150 gt;0.05 10.6 89.4

4 0.6221plusmn;0.0110 0.5670plusmn;0.0156 gt;0.05 8.8 91.2

5 0.6450plusmn;0.0093 0.6008plusmn;0.0104 gt;0.05 6.8 93.2

表二， 白藜芦醇和PEG-PLGA-RES纳米粒对HepG2（24小时）的抑制作用（n = 4，Xplusmn;SD）。

RES 纳米粒

剂量（mg/ml） OD 抑制率（%）

0.5 0.4778plusmn;0.0083 5.2

2.5 0.4645plusmn;0.0066 7.8

5 0.4263plusmn;0.0073 15.4

10 0.3528plusmn;0.0158 30.0

50 0.2645plusmn;0.0069 47.4

OD 存活率（%）

0.4803plusmn;0.0102 4.7

0.4698plusmn;0.0025 6.7

0.4473plusmn;0.0113 11.2

0.3743plusmn;0.0074 25.7

0.2928plusmn;0.0054 41.9

三 结果与讨论

3.1负载有白藜芦醇的PEG-PLGA纳米粒子的制备。

图1显示了RES-PEG-PLGA 纳米粒的粒度分布。负载有白藜芦醇的PEG-PLGA纳米粒通过双重乳化溶剂蒸发法制备。以下参数用于制备负载有白藜芦醇的PEG-PLGA纳米粒：超声功率为20％，乳化剂为F-68（0.5％），有机溶剂在旋转蒸发器中蒸发，旋转蒸发的温度为37。平均粒径为135.9nm，粒径分布窄，包封率为68.2％，载药量为8.34％。 此外，随着PEG-PLGA浓度的增加，粒子尺寸增加。

3.2 白藜芦醇的体外释放。

图2显示了从PEG-PLGA纳米粒体外释放出白藜芦醇的结果。在开始的两个小时内约有32％的白藜芦醇从纳米粒中释放，白藜芦醇的释放保持稳定需要约13天。累计释放量高达81％。PEG-PLGA纳米粒的药物释放行为符合Higuchi方程：Q = 3.4670t 40.346，R ^ 2 = 0.9582。 这些发现表明PEG-PLGA纳米粒可用于开发递送药物的纳米载体，这对于制备满足临床要求的药物控制释放系统可能是有价值的。

表三， 白藜芦醇和PEG-PLGA-RES纳米粒对HepG2（48小时）的抑制作用（n = 4，Xplusmn;SD）。

RES 纳米粒

剂量（毫克/毫升） OD 抑制率（%）

0.5 0.4773plusmn;0.0069 13.1

2.5 0.4270plusmn;0.0104 22.3

5 0.3800plusmn;0.0140 30.8

10 0.3203plusmn;0.0159 41.7

50 0.2265plusmn;0.0183 58.8

OD 存活率（%）

0.4798plusmn;0.0096 12.7

0.4325plusmn;0.0093 21.3

0.3863plusmn;0.0150 29.7

0.3428plusmn;0.0091 37.6

0.2240plusmn;0.0116 52.3

表四， 白藜芦醇和PEG-PLGA-RES纳米粒对HepG2（72小时）的抑制作用（n = 4，Xplusmn;SD）。

RES 纳米粒

剂量（毫克/毫升） OD 抑制率（%）

0.5 0.4300plusmn;0.0115 25.7

2.5 0.3915plusmn;0.0075 32.4

5 0.3708plusmn;0.0100 35.9

10 0.2768plusmn;0.0113 52.2

50 0.1943plusmn;0.0109 66.4

OD 存活率（%）

0.4100plusmn;0.0108 29.2

0.3648plusmn;0.0201 37.0

0.3520plusmn;0.0104 39.2

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