点击肽与水凝胶纳米粒子的缀合以用于肿瘤靶向药物递送外文翻译资料

 2022-06-20 11:06

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点击肽与水凝胶纳米粒子的缀合以用于肿瘤靶向药物递送

摘要：在这里我们介绍一种修饰的肽修饰的聚合物纳米粒子（NP）用于癌细胞靶向，可以将药物如多柔比星（Dox）递送到几种癌细胞中。具体而言，我们使用基于核仁蛋白的NP，其基于丙烯酰胺（AAm）和丙烯酸2-羧乙酯（CEA）的共聚物。带负电荷的co（CEA-AAm）NP使用高度有效且特异性的铜（I）催化的叠氮化物 - 炔点击反应与核仁蛋白靶向F3肽缀合。 F3肽与血管生成肿瘤血管系统和其他过度表达核仁素的肿瘤细胞结合。附加F3肽到NP上可增加表达核仁素的神经胶质瘤细胞系9L和乳腺癌细胞系MCF-7对NP的摄取。 值得注意的是，F3-缀合的NP显示出高于核仁素过表达的神经胶质瘤细胞系9L比乳腺癌细胞系MCF-7更高的摄取，后者在其质膜表面上具有较低的核仁素表达。 此外，F3肽还显着增强耐药细胞系NCI / ADR-RES对co（CEA-AAm）NP的摄取。 而且，用这种F3-共轭的共聚物（CEA-AAm）NP，实现了阿霉素的高负载和缓慢释放。

介绍

多柔比星（Dox）是最有效的化学疗法之一的药物。它已被广泛用于治疗几种癌症：白血病，膀胱癌，乳腺癌和其他癌症。Dox的临床应用受其副作用限制，例如心脏毒性以及多药耐药性。这些副作用与Dox的差的生物分布和不利的药代动力学有关。

靶向纳米颗粒（NP）递送已经成为克服上述问题的一种方法。（1）延长药物循环时间（2）控制药物释放动力学（3）提高疏水性药物的溶解度的策略作为药物递送载体。由于大分子的渗透性和保留（EPR）效应增强，水凝胶NP可以优先积聚在肿瘤组织中，特别是肿瘤血管系统中。这些NP还可以通过各种机制缓解癌症耐药性。例如，Pluronic P85胶束NPs可以与P-糖蛋白相互作用，这可以改变细胞膜结构并因此诱导细胞膜通透性。HER-2抗体缀合的聚（D，L-丙交酯共乙交酯）（PLGA）纳米颗粒与未修饰的PLGA纳米颗粒相比，已经显示通过受体介导的内吞作用改善了耐药卵巢癌细胞SKOV-3对Dox的摄取。已经显示AOT-藻酸盐纳米粒子可以递送Dox和亚甲蓝与耐药性NCI / ADR-RES细胞联合化疗和光动力治疗，其中亚甲基蓝同时用作P-糖蛋白抑制剂和光敏剂。此外，这些纳米颗粒的大小约为50纳米，应防止它们进入心脏组织，从而避免心脏毒性。

带负电的NPs是阳离子药物的重要输送工具，例如多柔比星。例如，通过丙烯酰胺（AAm），丙烯酸2-羧乙酯（CEA）与交联剂3-（丙烯酰氧基）-2-羟丙基甲基丙烯酸酯（AHM）在微乳液中的共聚制备新的带负电荷的水凝胶NP系统。这种钴（CEA-AAm）NP已被用作阳离子药物的递送载体，例如多柔比星（化疗药物）和维拉帕米（化学增敏剂）。 但是，这些的吸收由于阴离子细胞膜的排斥，肿瘤细胞的阴离子NPs是具有挑战性的。

解决这个问题的一种可能的方法是用肿瘤特异性靶向配体修饰NP表面，其对肿瘤特异性受体表现出高度亲和力。 这些靶向配体可以通过受体介导的内吞作用促进NP摄取，通过中和P糖蛋白介导的药物泵来克服耐药性，并且因此增加NP在肿瘤中的停留时间。12 尽管EPR效应是体内开发大分子抗癌疗法的基础，但主动靶向策略进一步提高了药物的选择性，疗效和治疗指数。

Nucleolin是细胞核和细胞表面之间的穿梭蛋白，在血管生成肿瘤血管系统和某些类型的肿瘤细胞中高度表达。核仁蛋白靶向F3肽先前已经附着到几种NP上，这在体外和体内均明显增加了它们被这种肿瘤和肿瘤内皮细胞摄取。 例如，F3-缀合的聚丙烯酰胺NP在体外与人肿瘤内皮细胞结合并在体内与人肿瘤血管结合。 此外，F3肽的附着减少了聚丙烯酰胺NPs到溶酶体的追踪。28 具有这种性质，F3-缀合的NPs阻止包封的药物进入酸性溶酶体，从而避免它们的潜在降解。目前的研究表明，这种F3肽可以增强负电荷NPs摄入肿瘤细胞。

化学上，F3肽在负电荷共轭（CEA-AAm）NP上的缀合一直是一个挑战。之前，F3肽以双功能PEG作为交联剂连接到胺官能化水凝胶NP上。29 这种双功能PEG可以通过NHS酯反应与来自NPs的胺基团反应，而与它们的马来酰亚胺基团反应可以与肽的巯基反应。然而，这种肽缀合方法不适合将F3肽连接到带负电的co（CEA-AAm）NPs上。为了将F3肽缀合到co（CEA-AAm）NPs上，我们发现点击反应是一个非常好的选择，因为它是模块化的，高产率，立体定向的，并且可以在环境条件下进行。

在这项研究中，我们计划通过直接的点击反应将F3肽连接到带负电的co（CEA-AAm）纳米粒子的表面上。 预计F3肽会增强癌细胞中这些NP的摄取。 Co（CEA-AAm）NPs通过自由基聚合合成，在反相微乳液体系中进行。然后用叠氮连接子修饰NP以进行下游修饰。炔烃-F3肽通过铜（I）催化的叠氮化物 - 炔点击反应与叠氮化物-NPs缀合。通过神经胶质瘤细胞系9L（核仁素的高表达），人乳腺癌细胞系MCF-7（核仁素的低表达）和人卵巢的F3-缀合的co（CEA-AAm）NPs（F3-NPs）的摄取效率通过共焦显微镜评估细胞系NCI / ADR-RES（耐药性）。 还评估了来自F3-缀合的NPs的阿霉素的加载和释放行为。

材料和方法

材料。 丙烯酰胺（AAm），丙烯酸2-羧乙酯（CEA），3-（APC），N，N，N#39;，N#39;-四甲基乙二胺（TEMED），二辛基磺基琥珀酸钠（AOT），Brij 30，二甲基亚砜，L-抗坏血酸，硫酸铜（II），磷酸缓冲盐溶片（PBS）和Tris（2-羧乙基）膦（TCEP）购自Sigma-Aldrich。 乙醇（95％）和己烷购自Fisher Scientic。 1-乙基-3-（3-（二甲基氨基）丙基）碳化二亚胺（EDC）和N-羟基磺基琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）购自Thermo Scientic。 人卵巢腺癌细胞系NCI / ADR-RES购自美国国立癌症研究所。 从美国典型培养物保藏中心（Manassas，VA，USA）获得9L大鼠胶质肉瘤和人乳腺癌细胞系MCF-7。 Roswell Park Memorial Institute培养基（RPMI-1640），4#39;，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），Gibco 0.05％胰蛋白酶-EDTA，购自Invitrogen的Gibco 100x青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺（PSG）和Gibco热灭活的胎牛血清（HI-FBS）。 乙炔-Fluor 488（AF488）购自点击化学工具。 购买1-（丙-2-炔-1-基）吡咯-2,5-二酮，来自Enamine Ltd.（乌克兰）。按照报道合成1-叠氮基-3-氨基丙烷。32 F3肽（KDEPQRRSARLSAKPAPPKPEPKP-KKAPAKKC）购自SynBioSci。 96孔微孔板购自BD Biosciences。 所有化学品都按原样使用，无需进一步纯化。 所有使用的水用来自Millipore的Milli-Q系统纯化。

co（CEA-AAm）NPs的合成4.脱氧己烷（45mL），AOT（1.6g）和Brij 30（4.3mL）混合并剧烈搅拌以产生微乳液。 将AAm（639mg），CEA（144mg）和AHM（428mg）的混合物溶于DI水（1.3mL）中，将其超声处理直至完全溶解。 在氩气氛下将单体溶液加入己烷溶液中。 20分钟后，加入在DI水（100mu;L，10wt％）和TEMED（100mu;L）中的新鲜制备的APS溶液以引发聚合。2小时后，通过旋转蒸发除去己烷。 将残余物悬浮在乙醇中并转移到Amicon超滤细胞（300kDa，Millipore Corp.）中。为了去除小分子杂质，将NP用乙醇（7x）和去离子水（7x）洗涤。 将NP溶液冻干并储存在-20℃的冷冻箱中。 以相同的方式合成聚丙烯酰胺（PAAm）NP（不含CEA）。

炔烃-F3肽的合成3.将F3肽1（2mg，10mg / mL在PBS buer中），1-（丙-2-炔-1-基）吡咯-2,5-二酮2（3.8mg，7.6 mg / mL，在DMF中）和TCEP（2.8mg，50mg / mL，在PBS中）混合在一起并搅拌过夜（方案1a). TCEP作为一个

还原剂以防止F3肽1的游离巯基形成二硫键。 将混合物在PBS buer中稀释10倍。 然后使用Amicon超滤池（1000Da; 5X在去离子水中）纯化NP，冷冻干燥并储存在冰箱中。 分子量用Agilent Q-TOF HPLC / MS系统分析F3肽1和炔-F3肽3。

使用超灵敏液相色谱法（UPLC）评估F3肽1和炔-3F3肽3的纯度，所述超高效液相色谱法在配备有光电二极管阵列检测器的Waters Acquity Peptide Mapping System上进行。 肽溶液（1mg / mL）在Acquity BEH C4柱（100times;2.1mm，1.7mu;m）上运行。 梯度洗脱是水/乙腈的混合物，其中水/乙腈的比例为99：1（v / v）至20:80。 流速保持在0.208mL / min。将0.14重量％的三氟乙酸A）在水中以及乙腈中用作抗衡离子。 柱温保持在35℃。

合成叠氮-PN 6.将co（CEA-AAm）NPs 4（10mg）以10mg / mL溶于PBS buer中，接着加入EDC（6.3mg）和磺基-NHS（7.3mg;方案1b). 将1-叠氮基-3-氨基丙烷5（3.4mg，在乙腈中50mg / mL）逐滴加入到NP溶液中。

混合溶液继续搅拌4小时。 叠氮化物NP（Scheme 6中的61) 用离心机过滤器（100k Da，4000g）纯化，使用PBS buer（4x）并以10mg / mL收集。 纯化的样品在使用前储存在4℃。

F3-缀合的NP的合成8.叠氮化物NP 6（10mg，炔烃-F3 3（1mg，H\O中10mg / mL），CuSO\（20mu;L，10mM水溶液）和L-抗坏血酸（10mu;L， 50mM在水中）混合在一起并在室温下搅拌过夜（流程图1b). 使用离心过滤器（100kDa，4000g，PBS 5x，DI水4x）纯化混合物。 将F3-NP 8溶液调整至10mg / mL并在4℃下储存。 通过定量氨基酸分析F3-缀合的NP8上的F3肽的量分析（QAAA，德克萨斯A＆M大学蛋白质化学实验室）。

AF488-标记的NPs的合成7.为了追踪NPs，NPs用炔官能化的荧光染料AF488。通过点击化学。AF488（20mu;g，在DMSO中10mg / mL），CuSO\（20mu;L，水中10mM）和L-抗坏血酸（10mu;L，50mM，在水中）加入到叠氮化物-NP溶液6（10mg，10mg / mL的PBS）中并搅拌4小时。 通过离心过滤器（100kDa，4000g，PBS 4x）纯化混合物。 使用前，AF488-标记的NP7（10mg / mL）在4℃下储存。

NPs的表征。co（CEA-AAm）NPs的尺寸和zeta电位（4，方案1) 使用Delsa Nano（Beckman Coulter）测量修饰之前和之后。 用Spectrum BX FTIR（PerkinElmer）分析NP的FTIR光谱。 \用Varian Inova 500MHz光谱仪分析NPs的H NMR谱。

将Dox加载到co（CEA-AAm）NPs中。 Dox被装入co（CEA-AAm）NPs 4或F3-NPs 8。将DI水中的颗粒溶液（10mg，10mg/mL）和去离子水中的Dox溶液（1mg，10mg / mL）混合在一起并保持搅拌过夜。 装载Dox的NP溶液通过离心机过滤器（100kDa，4000g，去离子水3x）纯化以除去未加载的药物。 从co（CEA-AAm）NPs释放Dox。 装载Dox的NP储备溶液（0.2mL，10mg / mL）用PBS buer稀释50倍。之后，将该药物负载的NP溶液（10mL，0.2mg / mL）在37℃的水浴中孵育。 在温育0,1,3,5,8和24小时后，取出1mL负载Dox的NP溶液并转移到离心机过滤器（100kDa）中。 将NP溶液在室温下以4000g离心15分钟，并收集原料用于UV可见分析。 鉴于PBS buer中游离Dox的轻易降解，显示游离Dox降解的校准是执行细胞培养和共聚焦显微成像。在含有10％HI-FBS和1％PSG的RPMI 1640培养基中培养人乳腺癌细胞系MCF-7，大鼠胶质肉瘤细胞系9L和人卵巢腺癌细胞系NCI / ADR-RES。 将细胞在8孔有盖玻璃系统（Nunc，Lab-Tek）上培养2天。之后，将细胞与AF488-标记的NP7和9（1.0mg / mL，在PBS buer中）孵育2小时。温育后，通过用新鲜DPBS buer漂洗三次来除去未结合的NP。将细胞用多聚甲醛溶液（4％的去离子水）固定15分钟，并用新鲜的DPBS buer洗涤三次。然后将细胞用DAPI染色5分钟，并用新鲜的DPBS buer洗涤三次。 用Olympus DSU（磁盘扫描单元）共焦显微镜分析NPs的荧光信号。 ImageJ程序分析了荧光图像的像素强度。 每次测量总共使用40个单元来获得定量像素强度分析数据。

竞争摄取测试。 将9L细胞与各种浓度的F3肽1（0,2,10和50mu;M）预温育。30分钟后，将AF488标记的F3-NP9（1.0mg / mL）加入到细胞中并将细胞再温育2小时。之后，将细胞用DPBS buer洗涤三次，并在无色RPMI培养基中温育。 用荧光显微镜研究F3-NPs 9的荧光强度并用ImageJ程序分析。

统计分析。 结果以平均值plusmn;标准表示

偏离至少三个独立的实验。

结果与讨论

co（CEA-AAm）NPs的合成与表征

通过反相微乳液聚合制备co（CEA-AAm）NP 4。动态光散射（DLS）分析表明，纳米粒子的流体力学大小为在PBS buer中57

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