二醛纤维素交联壳聚糖与高氨基基团含量的蛋白质吸附外文翻译资料

 2022-07-19 08:07

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二醛纤维素交联壳聚糖与高氨基基团含量的蛋白质吸附

摘要：交联壳聚糖是由Schiff碱制备的，Schiff碱是由醛基(DAC)和氨基壳聚糖经过还原反应制成的。DAC是由纤维素的高碘酸盐氧化作用并在100摄氏度热水中溶解1个小时得到的。通过加入不同剂量的DAC，制得三种浓度的DAC交联壳聚糖。由氨基组含量测定的交联度分别为3.8、8.3和12.1%。结果表明，在21天的稳定性试验中，在pH值2-9的范围内，DAC交联壳聚糖具有较高的稳定性，且没有发现细胞毒性。同时，增加了氨基的数量使得DAC交联壳聚糖有着高水平的牛血清白蛋白(BSA)的吸附能力，这是因为DAC和壳聚糖的分子链在多个点上发生反应，即使DAC交联壳聚糖具有较低的交联度，该现象依然存在。

关键词: 壳聚糖 二醛纤维素 交联 细胞毒性 蛋白质吸附物

1 介绍

壳聚糖是一种由天然生物聚合物基丁酯的脱乙酰化产物。与甲壳素和纤维素相比，甲壳素的氨基基团的存在提供了增强的溶解度和反应活性。壳聚糖是一种可生物降解的天然多糖，广泛应用于各种不同的应用领域，如废水处理、赤字处理技术支持、酶固定化和生物医学应用等。

壳聚糖需要交联，以改善不稳定的酸性和较低的机械强度。因此，要想在酸性区域使用壳聚糖，应通过交联或离子相互作用而对其进行交联，因为它在酸性区域中是溶液化的。某些试剂已被用于交联，如戊二醛、三聚磷酸盐、乙烯基、二甘醇醚、二异氰酸酯等。然而，这些交联剂是具有细胞毒性的，会损害生物的相容性。Genipin是一种天然的水溶性双功能交联剂，其细胞毒性比戊二醛低1万倍;然而，要保证交联材料的稳定性，要达到45.2、29.3、23.9%的壳聚糖含量分别为80、50和20%，而在胶状海绵中，要达到20%，在明胶神经管道中，要达到24-51%。

乙二醇组的碘化反应是一种很好的方法，可以将醛类引入多糖中。在纤维素中，这一反应的特征是，在葡萄糖单位的副羟基组之间，有选择性的分解，从而形成两个醛基葡萄糖组的两个醛组。该产品通常被称为二醛纤维素(DAC)。在水溶液中有较温和的条件，可以很容易地阻止乙二醇的加入。此外，通过改变反应时间、温度，或增加钠的含量，可以很容易地控制氧化程度。

通过简单的加热，我们发现98%氧化程度的DAC在简单加热的水中很容易溶解，我们研究了溶解过程中分解的程度。在80摄氏度的条件下溶解4小时或在100摄氏度下溶解1小时，，DAC聚合和醛含量并没有显著降低，但在升高温度和较长的孵化时间内，发生了严重的退化。DAC的悬浮液是一种透明的溶液，在冷却到室温时没有显示任何明显的沉淀。因此，它的水溶液可能对醛反应的水溶液反应过程有用，从而作为一种还原剂或交联剂。

最近，用溶解的DAC作为一种交联剂，试图将蛋白质交联。我们研究了低分子量的自粘蛋白纤维的稳定性。同时研究了交联胶原蛋白的交联率，并对其热稳定性和流变学行为进行了研究。虽然已经进行了一些研究，但是DAC的交联细节还不清楚。

因此，我们制备了交联壳聚糖和各种交联物，研究了DAC和壳聚糖之间的交联方式。此外，我们还试图开发与高游离氨基群体相关的壳聚糖，以改善氨基群体的活性。为了达到这一目的，我们采用高分子量的DAC，用高分子量的壳聚糖和蛋白质分子的吸附，用牛血清白蛋白(BSA)作为一种模型蛋白。BSA是一种常用的模型蛋白，因为它能增加信号的强度，在许多生化反应中不会反生反应，而且它的成本较低。

在此研究中，我们采用两种醛基循环单元控制了DAC的用量，从而得到了三种DAC交联壳聚糖的预处理。通过交联(自由氨基基团含量)和溶解度(稳定性)，对DAC的交联效果进行了仔细的研究。在BSA吸附的情况下，研究了一种具有较大氨基群体含量(较低交联)的聚氨基壳聚糖的效率。

2 实验

2.1 制备壳聚糖珠

壳聚糖10(2个w/v%，Mw 60times;1000，80%脱乙酰化，日本)溶解在水溶液中(1/v%)。在缓慢搅拌的过程中，将壳聚糖溶液加入到氢氧化钠溶液中(20 w/w%)。得到的珠子是用去水的水进行清洗的，反复的滴水，直到水是中性的。得到的壳聚糖具有固定的圆型，平均直径2厘米。

2.2 二醛纤维素的制备

在500毫升的水中，添加10克纤维素，并将它添加到10克纤维素中(1.5克，1.5克)。这种混合物在黑暗的室温下搅拌72小时(Kimet al，2004)。在剩余的骨膜中通过添加过量的乙二醇进行分解后，将该产品离心分离并进行冷冻干燥。在加入乙二醇之前，利用反应溶液中的一部分反应，在290纳米的溶液中吸收了碘。

2.3 交联壳聚糖的制备

所需剂量的二醛纤维素(DAC，0-1-0.3 g，或0.25-0.74倍摩尔的葡萄糖胺含量)溶解在10毫升100摄氏度的去离子水中一小时，并加入溶解了1克壳聚糖珠的90毫升去离子水。混合物在室温下被轻微搅拌4个小时，随后，在室温下加入NaBH4(3倍于醛基摩尔的含量)反应2小时，并通过重复的脱析和冻干来清洗产品。交联壳聚糖分别表示为CD1(0.1 g DAC)、CD2(0.2 g DAC)和CD3(0.3 g DAC)。为了测定未反应产物的含量，在蒸馏水中使用纤维素渗析膜(分子重量截止，1.4万)，反应后，水反应溶液被分解了2天。然后，将溶液冻干。为了评估细胞的生存能力，壳聚糖在交联用的葡萄糖醛(GA)与CD3所使用的DAC的数量相当(在mole基底下)。这个样本表示为CG3.2.4。

2.4 交联壳聚糖的溶解性

在pH 2(hcl-kcl)、5(乙酸)、7(磷酸盐)和9(硼酸盐)的20毫升溶液中，将100毫克的样品悬浮在20毫升的溶液中。在室温下搅拌21天之后，这些部分被彻底清洗，并确定了质量损失。所有的实验都是一式三份的。

2.5 氨基组含量测定

采用滴定法对壳聚糖的前/后交联中氨基基团的数目进行了评价。将一种100毫克的样品悬浮在40毫升的去离子水和10毫升的0.1%的盐酸中，然后添加到壳聚糖的悬浮物中。在室温下静置4小时后，进行测定，其中自由胺NH2的氨化胺NH3 的转化是由0.1nN NaOH的消耗量决定的。

2.6 交联壳聚糖的零电荷点

零电荷的点(pHpzc)是由间歇式的平衡实验决定的。50毫升的0.01 M NaCl溶液通过添加0.1 M HCl或0.1 M NaOH溶液，调整为PH为4-11。加入1克的壳聚糖和交链壳聚糖，最终的pH值是在室温下48小时后进行测定的。PHpzc的曲线图是由pHinital -pHfinalvs.pHinitial得到的。

2.7 元素分析

用原子吸收光谱法测定了壳聚糖和交链壳聚糖中的C、H和N的元素组成。

2.8 扫描电子显微镜(SEM)

在未进行交联的壳聚糖中，水是用来交换乙醇的，其次是叔丁醇。将样品冷冻在20摄氏度，冻干，涂上黄金，并使用s-4000扫描电子显微镜进行检查。

2.9 红外光谱

将冷冻干燥的样品压入一个小颗粒中，并将其放入溴化钾的颗粒中，并在4厘米的分辨率下进行了一个傅立叶变换红外(FTIR)光谱的记录。为制备装载CD和DAC的BSA样品，将20毫克的cd3和DAC与BSA(4毫克/毫升)混合，室温下，在pH值为5.5的醋酸溶液中溶解10毫升的醋酸盐溶液。在48小时后，将他们用离心法和冷冻干燥法收集。

2.10 细胞培养和毒性评估

由DAC(0.1克的CD3)或GA(0.1克的CG3)在室温下悬在10毫升蒸馏水中放置21天。在必须的潜伏期后，将溶液离心分离，并用于细胞毒性实验。hf-16细胞(人类包皮细胞，TEGO科学，韩国)在F12媒体(韩国，韩国)中注射10%的牛血清(FBS);Gibco，日本)，100个青霉素g/ml，100个链霉/ml(Sigma)。hf-16细胞在一个24孔的板(4 105cell/井水)上保持在37度的环境中，放在一个5%的c2大气压下，孵化后，在F12中，这些细胞被处理成含有CD3或CG3(最终浓度0.01%)的溶液。用DACor GA解决方案进行了同样的实验。这些溶液的浓度为0.01%，并在室温下维持了7天。利用MTT(3-4-二甲基噻唑-2-2)-2,5-二苯四唑)测定了细胞的能力。具体来说，在PBS溶液中溶解的MTT(5毫克/毫升)添加到每一个井中，而这个板在37摄氏度的孵化期是3.5个小时，细胞的生存能力是通过使用ELISA(美国生物rad)的595纳米的吸光度来确定的。蒸馏水作为对照试验，每一项试验都一式三份。

2.11 牛血清白蛋白吸附

为了评价牛血清白蛋白(BSA)的摄入，将100毫克的交联壳聚糖(CD2和CD3)和50毫升的BSA在室温下溶解在pH 2(hcl-kcl)、4-6(醋酸)、7(磷酸)和9(borate)中。BSA的浓度在1到4毫克/毫升之间。在指定的时间间隔内，该溶液的一个中心部分被移除，并以280纳米的波长进行紫外线检测。从标准的校准曲线上计算了BSA吸附样品的量。在室温下进行一式三份的实验。

3 结果与讨论

3.1 DAC交联壳聚糖的制备

二氧化二醛(DAC)的氧化程度为98%，通过在100摄氏度的高温下加热，以1 h为单位，使其氧化，并使之溶解，这一百分数表示每100个葡萄糖残余物中氧化葡萄糖的含量。壳聚糖和DAC之间的交联反应是在两个步骤中进行的(图1):（i）Schiff碱在壳聚糖氨基群体和DAC醛组(ii)随后在降解反应基础上的反应。表1列出了一些壳聚糖样品与游离胺的含量，还有在基元反应中未使用的氨基基团的含量，以及交联的程度。通过控制DAC的用量，分别对三种交联壳聚糖的含量进行了控制，分别为4.85、4.62和4.43 mmol/g。这些值分别对应于交联率为3.8、8.3和12.1%时的含量。虽然在交联中使用的氨基基团含量随着DAC的增加而增加，但是使用的醛基组的含量大约是相等的(约15-17%)，而不是增加DAC的数量。这一结果表明，在单一的DAC分子中，不同的醛基分子都是可以接触到的。大量未反应的DAC中的醛有两种可能的因素(图1):(i)一个DAC 与许多氨基反应，(2)大量醛基可以使未反应的席夫碱反应,这可能由于DAC和壳聚糖分子之间的空间干扰。

根据壳聚糖和DAC的总含量计算出的反应率为91.5%(CD1)，89.7%(CD2)，86.4%(CD3)。由于反应介质的pH值为6.8-6.9，所以在中性条件下，壳聚糖的溶解可能不会发生。然而，由于一些壳聚糖在反应过程中被分解成小块，所以在洗涤过程中完全恢复交联的壳聚糖是很困难的。因此，为了确定交联中使用的DAC的数量，在蒸馏水中使用纤维素渗析膜，剩余的水处理溶液被收集并冻干。经冷冻干燥后得到的DAC的数量大约是DAC总投入的10%。我们不知道DAC的含量是多少，因为在100摄氏度的治疗中，DAC的聚合度在1小时内轻微下降，而DAC在中性区域出现了一些大规模的损失。因此，我们不能通过交联来确定DAC的实际数量，但它必须小于总加入的DAC的90%。我们还对氮(N)/碳(C)比进行了元素分析，以确定DAC交联壳聚糖的引入。如表1所示，壳聚糖的N/C比为0.179，而交联壳聚糖的值CD1、CD2和CD3，分别为0.150、0.144和0.131。氮化比的显著减少是由于交联使用的DAC的增加。

图1显示了一种典型的电子显微镜图像。这种交联的壳聚糖是一种具有高度互联的气孔的纤维网。从交联的角度看，交联壳聚糖与壳聚糖的显微特征几乎没有变化。

3.2 DAC交联壳聚糖溶解度

Schiff碱在醛和氨基组之间的反应，以及随后的还原反应，使壳聚糖在低pH值上具有操作稳定性。由于交联壳聚糖的溶解度是一个重要因素，在室温条件下，21天的时间内，在一个0.1 M的缓冲溶液中，对样品进行了各种pH值的检测。图2展示了壳聚糖和交联壳聚糖的质量损失的时间历程。壳聚糖在中性和碱性中非常稳定，但在酸性条件下变得不稳定。如图2所示，在酸性条件下，壳聚糖的质量损失迅速，尤其是在pH值5的情况下，在24小时的治疗后几乎完全溶解。

这和众所周知的由于氨基基团的保护而引起的壳聚糖在酸性条件下的溶解是一致的。壳聚糖的溶解性是根据氨基基团的质子化程度和脱乙酰化程度的不同而形成的。我们对壳聚糖的溶解度进行了最小程度的保护，并降低了pH值，从而提高了氨基基团的质子化程度。同时，脱乙酰化程度对壳聚糖的可溶性有一定的影响，因为它影响了原生氨基酸的数量。壳聚糖在pH值为2时损失约为18%，而在pH值为5时损失最大，这是因为所使用的壳聚糖不是纯壳聚糖，其脱乙酰化程度为80%。目前我们还没有对由于PH的变化对壳聚糖的溶解度影响进行研究。目前人们对壳聚糖的进一步研究是相当有兴趣的，而且应该对壳聚糖的有效利用进行必要的研究。

与此相反，交联壳聚糖的稳定性较低，在酸性条件下的溶解度随交联程度的增加而降低。虽然壳聚糖的交联率较低(CD1)在pH值5的21天内显示出了大约23%的质量损失，但在pH值5的情况下，较高交联水平的壳聚糖(CD2和CD3)即使在pH值为5的情况下依然稳定，在21天后的质量损失小于1%。因此，DAC的交联改善了壳聚糖的稳定性，因为壳聚糖分子链可

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