具有表面固定化生物催化剂的微反应器系统中酶动力学的理论和实验研究外文翻译资料

 2022-08-07 02:08

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具有表面固定化生物催化剂的微反应器系统中酶动力学的理论和实验研究

娜塔莎·米洛兹 马丁·卢贝 米特娅·拉克纳 伊戈·普拉斯

（1）突出强调:

A.模拟了在微反应器中用x-转氨酶进行的连续氨基转移。

B.Z基本2标记的酶是基于离子相互作用固定在内表面上的。

C.应用了基于乒乓球bi-bi机制的表面反应动力学。

D.基于时间尺度分析，开发并验证了简化的一维模型。

E.可通过模型进行酶浓度估算和微反应器性能预测。

（2）图形摘要

（3）文章信息

A、文章历史：

2016年9月23日收到

2016年12月7日以修订版收到

2016年12月8日接受

2016年12月19日可在线获得

  1. 关键词：微反应器酶、固定化表面酶动力学、氨基转移数学建模

摘要

建立了一个数学模型，该模型包括在具有表面固定化转氨酶的连续操作微反应器内壁上进行的运输现象和酶催化反应。通过使用由选定的x-转氨酶ATA-wt组成的融合蛋白N-SBM-ATA-wt获得了定向的酶固定化，可实现酶活性位点的无障碍访问以及带正电的Z基本2标签，该标签与硅/玻璃微通道表面建立了离子相互作用。（S）-（-）-alpha;-甲基苄基胺和丙酮酸的酶催化转氨作用生成苯乙酮和L-丙氨酸，这是基于乒乓双联机理的表面动力学描述的。反应动力学参数是在使用各种初始底物的间歇系统中预先定义的浓度并进一步应用于表面反应描述中。根据普遍存在的动力学和对流/扩散现象，可以将开发的模型简化为一维模型，该模型可以进行固定化酶浓度估算，并且与各种流量和入口底物浓度下微反应器出口的实验数据显示出良好的一致性。此外，该模型成功地预测了两个连续连接的涂有N-SBM-ATA-wt的微反应器的性能，并可进一步用于设计和优化表面固定化酶催化的手性胺合成的有效和可持续过程。

1.介绍

在过去的二十年中，微型技术已成为许多（生物）化学应用的有力工具，分析以进行工艺开发和工业生产。反应器体积的减小和高的表面体积比导致质量和传热的显着提高，从而提高了安全性并减少了废物的产生。微反应器系统中的过程通常以连续流模式执行，由于层流通过微通道，因此严格控制过程参数和反应时间是可行的。微反应器的使用可增强过程并促进基于在线或在线分析以及下游处理的过程监控集成。此外，基于并行化多个反应器单元的编号概念得以实现，以获得大规模的生产系统，从而消除了常规反应器中通常繁琐的按比例放大的需求，特别是对于催化反应而言。

最近的几篇评论论文强调了机遇和在分析和化学生产中，微型技术也面临着孤立的酶或全细胞生物催化过程的挑战。生物催化剂固定化是优选的并且通常用于微反应器系统中，因为它允许连续的操作模式，通常稳定生物催 化剂并促进产物分离以及生物催化剂的回收，从而使其能够重复 使用。微型反应器中也可以采用常规反应器中使用的各种固定方法，但是，探索微流体装置大的表面体积比的表面固定通常是选择的技术，因为它尤其可以防止背压的增加，这是常见的填充床 或整体式微反应器的问题。

另一方面，生物催化剂的固定化可以改变酶。由于构象变化，空间位阻或酶与支持物的非定向附着而导致活性丧失，从而导致无法接近的活性位点，并可能导致底物和产物向生物催化剂活性位点和从生物催化剂活性位点扩散的额外限制。导致反应动力学的变化。为了防止这些影响，有人建议使用引入带正电的诸如Z基本2（也称为二氧化硅结合模块，SBM）的标签来诱导离子相互作用，该标签是从葡萄球菌蛋白A的B结构域获得的7 kDa三螺旋束，其精氨酸含量较高。带有负电荷的硅或玻璃微反应器壁，从而导致“智能”酶固定化。最近，在单个蔗糖磷酸化酶分子中引入了多个Z基本2模块，这甚至提高了固定 化的有效性酶最多增加两倍。

在这项研究中，通过使用与所选xtransaminase ATA-wt融合的带正电的Z基本2标签，可以将定向酶固定在硅/玻璃微通道内壁的表面。x-转氨酶是吡ido醛50-磷酸（PLP）依赖性酶，具有广泛的底物范围可催化氨基从胺供体向前手性酮底物受体分子的可逆转移，而无需相邻的羧酸部分与其他转氨酶共同作用。这些酶作为有前 途的生物催化剂而受到关注，因为它们可以可持续地生产具有手性胺部分的对映体纯化合物，因此是中间代谢物和药物的基本组成部分。最近，对使用紫细菌x-转氨酶进行该反应的反应机理进行的详细研究证实，乒乓双双酶机理由两个半反应组成，如图1所示[18]。

反应从静止状态的酶（E-PLP）开始，即内部亚胺亚胺形式，其中辅因子PLP通过共价席夫碱键与活性位 点赖氨酸残基结合。结合含胺的底物（（S）-a-MBA）后，转铝反应会释放出赖氨酸残基，在此过程中，底物与底物之间的外部醛亚胺形成PLP。外部醛亚胺通过催化赖氨酸在alpha;-碳原子上发生质子提取。然后使辅因子质子化，并通过醌类碳负离子进行内部重排，产生酮亚汀。酮亚胺中间体的水解产生游离的赖氨酸和吡ido胺50-磷酸（PMP），从而形成酶的PMP形式（E：PMP）并生成相应的酮产物（ACP）。完整的催化循环包括第二个半反应，这是与另一种酮氨基受体（PYR）逆转 的这些步骤。PMP的脱氨基导致胺（L-ALA）的形成，并伴随转化（即再生）为酶的PLP形式。

这项工作的目的是有效描述和预测表面固定的微反应器的性能x-转氨酶包括乒乓球bi bi机制。描述微反应器的典型方法，其反应在通道壁应在基于连续性的宏观质量平衡方程的边界条件下进行反应，该方程涉及对流和扩散质量传输，而反应动力学参数则由于固定化而改变了酶的活性。在这里，我们避免将反应体积引入模型中，并通过使用表面生物催化剂浓度来描述表面反应动力学。这使我们能够使用在均质系统和异质系统中初步获得的相同动力学参数，根据我们的最佳知识，该系统尚未执行。针对间歇和连续系统开发了数学模型，并进行了详细的数值分析以验证所提出的模型。此外，应用了时标分析，并用于评估在已开发的具有不同表面酶动力学的微反应器中进行的连续生物过程中发生的限制机制。此外，用在两个连续连接的固定化酶的微型反应器中获得的实验数据验证了该模型。

图1. N-SBM-ATA-wt与辅因子PLP（E-PLP）催化的转氨反应方案，其中（S）-a-MBA和PYR通过可逆转化为ACP和L-ALA乒乓双双催化循环由两个半反应包括PLP向PMP的可逆转化[18]。括号中的名称表示模型中使用的物种术语。

2.材料与方法
2.1 化学制品

化学品-（S）-甲苄胺（（S）-a-MBA）、丙酮酸钠（PYR）、苯丙酸、苯乙酮（ACP）、

5rsquo;-磷酸吡哆醛（PLP）、磷酸二氢钠二水合物和乙腈购自Sigma- Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。

磷酸二氢钠一水合物和氢氧化钠溶液50％来自默克公司（德国达姆施塔特），而96％乙醇来自Kemika公司（克罗地亚萨格勒布）。在整个实验中均使用去离子水。

2.2 生物催化剂

N-SBM-ATA-wt的粗制物由c-LEcta GmbH（德国莱比锡）提供。使用的酶是修饰的（S）-选择性x-转氨酶ATA-wt，它是在cLEcta菌株收 集物中的生物多样性筛选中发现的。为了制备Z基本2标记的酶，需要使用Z基本2标签如文献[11-13]中所述，将其与ATA-wt酶的N末端融合产生NSBM-ATA-wt。

2.3 微反应器

为了开发具有固定化的N-SBM-ATA-wt的微反应器，使用了硅/玻璃 曲折芯片。这些芯片由iX-factory GmbH（德国多特蒙德）提供，并具有光滑的内壁（表面粗糙度lt;100 nm），并且微通道的内部尺寸为50 lm（h）400 lm x（w）x1620毫米（l）。对于实验工作，使用了芯片封装在定制的芯片固定器中，该芯片固定器与来自哈佛仪器的高压注射泵（PHD 4400注射泵系列）的VICIreg;Jour全氟烷氧基（PFA）管（VICI AG International，瑞士Schenkon）提供了无泄漏连接。

2.4 具有表面固定化酶氨基转移酶的微反应器系统的开发

将N-SBM-ATA-wt固定在未经处理的硅/玻璃曲折芯片的内表面上， 该芯片先前已与pH 8的50 mM磷酸钠缓冲液孵育1小时。浓度为1 mg粗酶的酶溶液然后将在相同缓冲液中制备的每mL制剂加入微通道，并孵育1小时。然后将微通道用50 mM磷酸钠缓冲液彻底冲洗，以去除所有未结合的蛋白质。酶固定是在23°C的恒温室中进行的，至少重复三次。

2.5 固定效率的确定

基于入口溶液和出口溶液中蛋白质浓度的测量并通过计算由此固定化的酶的量来估计酶固定的效率。使用Shimadzu Corp.（日本京都） 的分光光度计Shimadzu UV-2600，通过在205和280nm处的吸光度测量，通过分光光度法确定蛋白质浓度。

2.6 x-转氨酶催化生物转化过程

（S）-a-MBA和PYR向苯乙酮ACP和L-ALA的生物转化，以及ACP和L-ALA 向（S）-a-的转化由N-SBM-ATA-wt催化的MBA和PYR始终在30°C的pH值为20的20 mM磷酸钠缓冲液中进行，该缓冲液含有0.1 mM的辅因子PLP。

2.6.1 带有游离x-转氨酶的批量生物转化

为了防止酶吸附在玻璃表面上，在15 mL塑料离心管中进行了带有游离N-SBM-ATA-wt的批量实验。反应混合物的总体积为10mL，同时通过微磁力搅拌棒混合器促进了在500rpm下的最佳混合。使用的初始底 物浓度在10至100 mM的范围内，反应混合物中最终的粗酶制剂的最终浓度在0.08至0.32 kg m-3之间变化。实验至少进行了三次重复，并进行了采样。以预定的时间间隔从反应混合物中分离并在0.1M氢氧化钠溶液中 稀释5倍以使酶失活并终止反应。

用于测定酶比活性的测定是在30°C下使用40 mM初始等摩尔浓度的（S）-a-MBA和PYR和粗制酶制剂以0.16 kg m-3的浓度进行的[21]。比活性表示为在所述条件下线性增加的过程中每分钟每毫克粗酶制剂形成的1摩尔ACP（1摩尔mg-1 分钟-1 ； Umg-1）。实验是至少三个重复。

2.6.2 表面固定的x-转氨酶在微反应器系统中的生物转化

在表面固定有N-SBM-ATA-wt的硅/玻璃微反应器中进行连续生物转化过程，入口底物浓度范围为10至40 mM，体积流量在2至32 lL min-1之间。将来自微通道出口的反应混合物在0.1 M氢氧化钠中稀释1倍，并进一步通过在线HPLC分析进行分析（图2），从而可以直接跟踪底物和产物的浓度。

2.7 测定底物和产物浓度

用SPD-M20A紫外可见分光光度法测定了基质和产物的浓度，该系统采用Shimadzu Corp.（日本京都）和Geminireg;3 lm的SPD-M20A UV / Vis检测器，NX-C18 110Aring;，LC色谱柱，150 x 4.6毫米，Phenomenex（Tor-美国加利福尼亚州兰斯）。（S）-a-MBA和ACP的浓度用乙腈：H2O 混合物（1：1）测定，用氢氧化钠溶液将pH调节至11，以流速作为流动相使用最小1 mL-1。样品进样量为1 ll的分析是在30°C且在260 nm处检测到的。（S）-a-MBA和ACP的保留时间分别为2.6分钟和3.4分钟。在分析之前，将批量实验的样品在0.1 M氢氧化钠中稀释5倍，并在13,000 rpm（14400g）下离心5分钟。为了监测微反应器系统中的连续生物转化过程，使用了在线HPLC分析，并用0.1 M氢氧化钠溶液进行了1倍集成稀释，从而排除了人为因素并使整个过程中的实验误差降至最低。

  1. 数学建模

如引言中所述，酶促氨基转移反应遵循乒乓球双双机制。反应是可逆的，由两个半反应组成（图1），其中辅因子PLP交替充当 氨基的受体和供体，在醛（PLP）和氨基（PMP）形式之间穿梭。

假设酶复合物中产物的形成不是限制性步骤，则具有相应动力学常数的反应方案可以表示为：

然后由八个反应常数定义反应速率和平衡，其中四个描述正向反应（kf），另外四个描述反向反应（kb）。

具有表面固定化生物催化剂的微反应器系统中的底物A在稳态条件下，质量守恒方程为：

具有相关的初始条件和边界条件：

其中CA0是基质A的入口浓度，DA是基质A在水溶液中的扩散系数， vz是流体在z方向上的速度。

几种化学过程现象可能在微反应器性能的表征中起作用，并且通过时间尺度分析获得的特征时间尺度表明哪种现象对整个过程 流程表现出最大的阻力。较大的特征时间常数反映了较大的传输 现象阻力。为了分析微反应器性能，对流和扩散质量的影响评估根据以下时标常数进行运输和表面酶催化反应的速率：

其中smrt是平均停留时间，sdiff -x在x方向上的扩散时间，sdiff -y 在y方向上的扩散时间，sr是反应时间。VR 分别是微反应器的体积，h和w微反应器的高度和宽度，而vavg是平均流体速度和f体积流速。

为了确定物种扩散系数，采用了经验相关性[22,23]。考虑到底物和产物的扩散时间与反应时间相比足够短，可以将三维形式的微分方程组简化为一维（1D）形式：

其中a是微反应器的比表面积，通量A基材A的摩尔通量，而h和w分别是微反应器的高度和宽度。

表1总结了针对每种反应物种编写的分批和连续生物转化过程的守恒方程式。

假设在酶固定在微通道表面上的连

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