增强乙醇呼吸链的巴氏醋酸杆菌的高强度食醋发酵外文翻译资料

 2022-08-08 09:08

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增强乙醇呼吸链的巴氏醋酸杆菌的高强度食醋发酵

齐正良，杨海林，夏晓乐，王旺，余晓斌

接收：2013年11月10日/修订：2014 年2月3日/采用：2014年2月5日

copy;韩国生物技术与生物工程学会和Springer 2014

摘要：寻求醋酸菌（AAB）发酵高强度醋仍然是醋生产者的任务。位于醋酸菌细胞内膜上的乙醇呼吸链直接负责醋的发酵。在用巴氏醋酸杆菌CICIM B7003进行的半连续醋发酵中，醋酸化率与乙醇呼吸链中酶的活性呈正相关。为了取得高强度发酵过程，设计了一系列试验来提高醋酸菌乙醇呼吸链的活性。最后，通过添加一些与乙醇呼吸的相关因子的前体（亚铁离子和 beta;-羟基苯甲酸）并增加通气速率（0.14 vvm），可以增强醋酸化作用。最终结果是，平均醋酸化率提高到2.29plusmn;0.02 g/L/h，比原始水平高出28.7%。同时，发现通过合理平衡三个因素可以增强醋酸菌细胞氧化乙醇为醋酸的能力：乙醇呼吸链中的酶活性，泛醌前体的生物合成和通气速率。

关键词：巴氏醋酸杆菌，乙醇呼吸链酶，泛醌生物合成，供氧，醋酸化率

1.介绍

醋酸菌（AAB）已被分类为醋杆菌科的一类，属于嗜酸杆菌属alpha;细分中的嗜酸细菌的一个分支，其具有三个主要属：糖杆菌，醋杆菌和糖醋杆菌[1-4]。已知，醋酸菌具有氧化发酵特性，该特性导致糖和乙醇的氧化产物的快速积累，但至少在其早期生长阶段不参与这些基质的同化[5,6]。在这些微生物中，细菌呼吸系统直接作用于这些氧化发酵。

根据末端氧化酶的类型，细菌呼吸系统可分为两类：细胞色素C氧化酶呼吸系统和泛醇氧化酶呼吸系统。根据对醋酸菌的大量研究，氧化发酵是通过与泛醇氧化酶相连的膜结合脱氢酶进行的[7,8]。从这个意义上讲，醋酸菌的呼吸链被归类为泛醇末端氧化酶呼吸系统[9]。此外，醋酸菌具有四种不同的泛醇末端氧化酶，即细胞色素o，细胞色素a1，细胞色素d和抗氰的旁路氧化酶，它们并不只存在于醋酸杆菌，也可以在其他细菌中发现[6,10]。

典型的氧化发酵系统是乙醇呼吸链，这是醋酸菌独有的醋产生途径[7,11,12]。尽管早在之前就对醋酸菌的呼吸链的鉴定做了很多工作，但很少有学者尝试进行呼吸链研究来改善醋的发酵。因此，认识醋呼吸系统对醋发酵的调节意义重大。在目前的工作中，初步分析了半连续醋发酵过程中乙醇呼吸链酶活性与醋酸化率的关系，然后根据所获得的关系，通过增强乙醇呼吸链来改善高强度醋发酵。

2.材料和方法

2.1.细菌，培养基和培养条件

本研究使用的是从一家酿酒厂分离的醋酸杆菌CICIM B7003。使用两种培养基：种子培养基YG1（每100 mL蒸馏水1 g葡萄糖和1 g酵母提取物）和发酵培养基YG2（每100 mL蒸馏水0.5 g酵母提取物，0.5 g葡萄糖，0.04 g MgSO4，0.06 g KH2PO4）。接种前将无水乙醇和醋酸加入培养基中。

将巴氏醋酸杆菌 CICIM B7003 接种到装有 32 g/L 乙醇和 10 g/L 醋酸的 YG1（50 mL）培养基的无挡板锥形瓶（250 mL）中。接种后的锥形瓶在THZ-22(8)台式恒温振荡器中以170转/分、30℃培养24小时。

2.2.膜制备

将液体培养基以 8,000times;g 离心10 分钟以接收细胞沉淀，并用50 mM磷酸钾缓冲液（KPB，pH5.8）洗涤两次，然后重悬于同一缓冲液（每克湿生物质4 mL缓冲液）中。之后，用超声波（240W 55 kHz，1s / 3s）破坏细胞悬液，得到细胞破碎液。将该破碎液以 8,000times;g 离心 10 分钟以除去沉淀物，然后将可溶部分以100,000times;g超速离心1.5 h。超速离心后，倒出可溶部分，并将沉淀物重悬在10 mM KPB缓冲液（pH5.8）中作为膜组分[13,14]。所有这些步骤均在 4℃下进行。

2.3.酶法

根据在275 nm处的吸光度的增加，在25°C下用分光光度法测量了 9H2的氧化酶活性。反应混合物（总共1 mL）包含50 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.5），30mu;M喹诺醇，0.02%Tween 20和制备的膜（0.5 mg）。通过使用毫摩尔消光系数为12.25的对苯二酚来计算活性[15]。

膜结合乙醇脱氢酶（ADH）和受体进行比色测定醛脱氢酶（ ALDH） 。稍加修改[16]。分析混合物包含50 mM磷酸钾缓冲液（pH6.0），1.0 mM测试底物，1 mM铁氰化钾和5 mg /L膜蛋白。通过添加底物开始反应，并通过测量OD660来检测铁氧化合物的还原。一单位OD660定义为在这些条件下每分钟导致铁氰化物每分钟减少1 mM的活性。

所有这些测定均在25℃下进行。使用Bradford方法进行蛋白质定量。

2.4.半连续醋发酵

在Frings 9 L醋酸发酵罐中进行半连续醋发酵。运行模型示意图如图1所示。

为了启动过程，将具有34 g/L乙醇和10 g/L醋酸的5.4 L YG2倒入该醋酸发酵罐。之后，将培养基与0.6 L菌液充分混合，这些菌液在其指数生长期（OD600的0.8~1.0，约培养基与0.6 L菌种充分混合，菌种中微生物数量庞大，处于指数生长阶段(OD600为0.8~1.0，约为5times;108 CFU/mL)。通气速率为43 L/h (0.12vvm)。当残留乙醇浓度低于 4 g/L 时，将含有380 g/L乙醇的0.6 L YG2在2小时内缓慢添加到发酵罐中，以继续启动过程。同时，通气速率设定为54 L/h（0.15 vvm）。当醋酸含量增加到70 g/L左右，残余乙醇不足4 g/L时，完成后续工艺。整个过程的温度设定为30℃。

在启动过程之后，进行半连续发酵。当残余乙醇小于4 g/L时，进行新的分割处理。新的重复批处理的操作是排出总工作量的43％（v/v），然后加入相同体积的含有60 g/L乙醇的新鲜YG2培养基。此时，细菌种群被稀释并建立了新的环境条件。在数小时内，与之前的重复生产一样，发生了类似的醋酸化过程。温度设定为30℃，通气速率为43 L/h（0.12vvm）。完成四批处理后，对醋酸发酵罐执行了完整的维护程序（容器和传感器的清洁，泵的维修等）。

图1.在Frings 9 L醋酸发酵罐中半连续醋发酵的操作模型

2.5.设计用于改善乙醇呼吸链活性的实验

使用上述发酵方法，设计了一系列试验来增强乙醇呼吸。在第1组中，未添加乙醇呼吸相关因子的前体。在第 2 组中，在批次 1 开始时将beta;-羟基苯甲酸（beta;-HBA）添加到5 mg / L的浓度，然后将包含5 mg/L beta;-HBA的新鲜YG2供后续批次使用。同样，在第3组中，在批次1开始时将硫酸亚铁（FeSO4）添加至10 mg/L，并为后续批次提供新鲜的YG2和10 mg/L FeSO4。在第4组中，开始发酵时分别添加FeSO4和beta;-HBA浓度分别为10和5 mg/L，随后的发酵参照第2组或第3组发酵，其中新鲜的YG2与10 mg/L FeSO4和5 mg/L beta;-HBA。在第5组中，添加的前体与第4组中的相同，但是不同之处在于通气速率增加至51L/h（0.14 vvm）。

2.6.其他分析步骤

用0.1M NaOH以酚酞作为pH指示剂测量培养基的酸度。乙醇由ALKOSENS在线测定。乙醛用气相色谱仪HEWLETT PACKARD 5890 Series II，毛细管色谱柱Carbowax 20M在Chromosorb 0.2 micro;m和FID检测器上进行分析。使用Pye Unicam SP6-450分光光度在1 cm光程比色皿中针对水空白测量OD600。使用ClarkY氧气电极使用53YSI氧气计[17]测定溶解的氧气张力。使用紫外可见分光光度计通过在600 nm 处的光密度测量来测量总生物量，并将样品稀释至合适的浓度，使OD600的值保持在0.3到0.8之间（1OD600=0.43g干细胞每升）。醋酸与乙醇的转化率（CRA/E）计算公式如下：

CRA/E(%)=*100%

其中Yacid是培养基中醋酸的浓度（g/L），而Calcohol是在相同培养基中消失的乙醇的浓度（g/L）。

在这项工作中，所有实验都重复了三遍。使用 8.01版本的统计分析程序确定统计显著性。相应的表和图中显示的数据是实验的平均值，误差线表示标准偏差。方差分析显示出显着性（Ple;0.01）。

3.结果和讨论

3.1. 实验室规模的醋酸发酵罐中半连续醋发酵

如图2所示，在整个半连续发酵过程中，三个发酵阶段依次出现。首先是启动阶段（0~44 h）。这是为了获得高质量的生物质（0.6 g 干细胞/L），该质量保证了随后的醋酸化过程能够顺利进行。在该阶段结束时，累积了约70 g/L的醋酸。第二阶段为适应性阶段，分一批或者两批进行，在这个阶段中，巴氏醋酸杆菌的CICIM B7003细胞逐渐适应了发酵方式。之后，第三发酵阶段稳定发酵期开始。通常，稳定的发酵阶段意味着正式的醋发酵过程的开始。在该阶段，进行了四个重复的发酵批次。每批发酵的时间为16~17 h。得到69.83plusmn;0.12 g/L醋酸，平均醋酸化率（raver）为1.80plusmn;0.01 g/L/h，CRA / E为(90.33plusmn;0.19)%.。通常，在工业液态醋生产的适应性发酵阶段之后，进行30~40次重复发酵（持续约35~40 天），而在本文中仅进行了4次重复发酵以研究发酵动力学。

图2. 巴氏醋酸杆菌CICIMB7003在在Frings 9 L醋酸发酵罐中进行半连续醋发酵曲线

符号:(■)醋酸，(●)乙醇，(▲)生物质。

3.2. 乙醇呼吸链酶活性与醋酸化率的关系

醋化率（racid）是醋发酵的重要技术指标之一。为了分析醋酸化性能，对稳定发酵阶段中重复批次的醋酸累积曲线进行了积分测定。因此，获得了醋酸化率（racid）与发酵时间的关系，酸度（红线）的总体趋势也得到了记录（图3）。从总体趋势来看，酸度在开始时（2小时）较低（0.5 g/L/h），在4小时后逐渐升高。然后，它明显加速并在8至12小时内保持较高水平（大于2.5 g/L/h）。在发酵的后期（13~16 h），尽管有相当数量的活细胞可用，但不可避免地出现了酸性降低。降低主要归因于残留乙醇浓度低（低于10 g/L），这降低了膜结合乙醇脱氢酶的活性。

根据我们最近的研究，已经提出了巴氏醋酸杆菌CICIMB7003的乙醇呼吸链模型（图4）。只有三种酶，乙醇脱氢乙醛酸脱氢酶（ADH），醛脱氢酶（ALDH）和泛醇细胞色素o末端氧化酶（Cyto）参与了醋酸化反应。根据图3所示的结果，所有酶在开始时都处于低活性水平（0~2 h），因为在此期间，巴氏醋酸杆菌CICIM B7003细胞将其主要能量用于适应新的环境条件，而乙醇氧化并不是主要的代谢需求。克服这一阶段，酶的活性随着醋酸化的加速而逐渐增强：醋酸化越快，酶的活性就越高。当重复分批发酵接近尾声时，酶活性也下降。因此，可以得出结论，乙醇呼吸系统中所有酶的比活性与醋酸化率呈正相关，可以通过调节乙醇来调节醋酸化率。

图3.半连续发酵过程中，乙醇呼吸链中醋酸化速率和酶活性的变化。

符号:ADH(左)、ALDH(中)、Cyto(右)、(■)循环1的醋酸化率、(●)循环2的醋酸化率、(▲)循环3的醋酸化率。红线为醋酸化率的多项式拟合。

图4.乙醇呼吸链模型。ADH：乙醇脱氢酶，ALDH：乙醛脱氢酶，PQQ：吡咯并喹啉醌，Q：泛醌，OmpA：膜外蛋白A。

图5.设计用于增强乙醇呼吸链的实验原理图。

3.3.增强乙醇呼吸链的最佳方法

通过对乙醇呼吸链运行机理的综合分析，考虑了可能影响乙醇呼吸链活性的三个方面（图5）。首先是酶在乙醇呼吸系统中的活性，因为它们作为乙醇代谢的调节剂，

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